技術(shù)簡(jiǎn)介
m5C RNA是近年來(lái)發(fā)現的一類(lèi)在tRNA及rRNA高豐度存在的甲基化修飾。利用高通量測序手段驗證了非編碼RNA以及部分mRNA中m5C存在，但是在不同物種、不同組織中m5C修飾分布圖譜尚沒(méi)有系統性報道。云序生物率先開(kāi)展m5C RNA甲基化測序服務(wù)，采用經(jīng)典重亞硫酸鹽處理的方式進(jìn)行測序（Bisulfite Sequencing, 簡(jiǎn)稱(chēng) Bis-seq）。在全轉錄范圍內及tRNA水平查看基因m5C甲基化修飾水平。此外，云序生物亦提供 m5C 甲基化免疫沉淀測序（m5C Methylation Immunoprecipitation Sequencing，簡(jiǎn)稱(chēng) m5C MeRIP-seq）服務(wù)，助力 m5C 修飾研究。

 云序生物（m5C）RNA甲基化測序流程

云序生物RNA甲基化測序產(chǎn)品

云序優(yōu)勢

一站式服務(wù)：
客戶(hù)只需提供組織、細胞、體液樣品或RNA，云序生物為您完成m5C RNA-Seq全套實(shí)驗服務(wù)。
嚴格的質(zhì)控：
云序生物對m5C RNA-Seq實(shí)驗每一步驟均設有關(guān)鍵質(zhì)控，保證客戶(hù)得到高質(zhì)量質(zhì)數據。
專(zhuān)業(yè)的生物信息學(xué)分析：
云序生物擁有專(zhuān)業(yè)的生物信息分析團隊，幫助客戶(hù)進(jìn)行實(shí)驗數據的挖掘。

樣本要求
樣品類(lèi)型：
細胞、新鮮組織或RNA樣品。其它類(lèi)型樣品請詳詢(xún)。
樣品量：

a) 細胞：2×10⁷ 

b) 組織：100 mg-1 g

c) RNA：30-300 μg（OD260/280：1.6-2.3；RNA無(wú)明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7）

樣品運輸與保存
樣品運輸：樣品置于1.5mL離心管中，封口膜封好，干冰運輸。
樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存；RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。

云序數據分析（僅供展示，詳見(jiàn)demo報告）
1、識別RNA甲基化位點(diǎn)
通過(guò)高通量測序和生物信息分析，識別甲基化富集的基因組區域。

2、RNA甲基化位點(diǎn)的注釋※
富集峰識別后，得到的是一堆基因組位置信息，通過(guò)生物信息分析利用鄰近基因對富集峰進(jìn)行注釋?zhuān)⒏鶕逯悬c(diǎn)相對于已知基因的位置，將富集峰為啟動(dòng)子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰。

3、RNA甲基化位點(diǎn)在基因組中的分布※
根據注釋信息，繪制富集峰在不同基因組特征上的比例圖。

4、RNA甲基化位點(diǎn)Motif分析※
RNA上甲基化的位點(diǎn)，可能包含某種序列motif。RNA甲基化酶可能正是通過(guò)識別這些 motif 特異性進(jìn)行甲基化修飾，從而完成轉錄后調控功能。我們成功識別了全基因組的RNA上的甲基化位點(diǎn)后，獲取序列就能使用生物信息學(xué)的手段來(lái)搜索這些 motif，從而揭示 RNA甲基化修飾的機制。

5、差異RNA甲基化位點(diǎn)的識別與注釋
云序生物使用meRanCompare軟件識別兩個(gè)/組樣品間的差異甲基化位點(diǎn)，以FDR<0.01作為閾值，具體的以測序報告為準。 識別樣本間的差異甲基化區，發(fā)現與特定表型或疾病相關(guān)的甲基化區域。

6、差異RNA甲基化位點(diǎn)的GO與信號通路分析
對差異甲基化基因進(jìn)行功能分類(lèi)，并發(fā)現明顯富集的功能條目。

案例解析
案例1：m5C RNA甲基化調控mRNA出核新機制

原文：5-methylcytosine promotes mRNA export — NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader

期刊：Cell Research 影響因子：15.60

中科院汪海林等研究團隊揭示了m5C修飾在mRNA的分布圖譜規律及其對調控mRNA出核作用新機制。研究人員建立了改進(jìn)的RNA m5C單堿基分辨率高通量測序與生物信息分析技術(shù)，以此揭示mRNA m5C的分布規律，并繪制了精細的m5C修飾圖譜，發(fā)現m5C在mRNA的翻譯起始位點(diǎn)下游有明顯富集，并且主要分布于CG富集區域。通過(guò)分析對比人和小鼠不同組織，發(fā)現m5C在mRNA上的分布特征在哺乳動(dòng)物中十分保守，而在不同組織中修飾的基因具有特異性。研究團隊同時(shí)發(fā)現，在小鼠睪丸發(fā)育過(guò)程中，動(dòng)態(tài)的m5C修飾基因明顯富集于精子發(fā)育相關(guān)功能，提示m5C修飾參與生殖發(fā)育調控。

圖1. mRNA中m5C的分布規律及組織特異性表達

案例2: m5C RNA甲基化基因組分布圖譜

原文：Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain 

期刊：Genome Biology 影響因子：13.21

近期刊登了解析RNA m5C在不同組織細胞的分布圖譜相關(guān)文章。研究人員選取小鼠胚胎干細胞（ESC）和腦組織（n=3）作為實(shí)驗樣本，利用m5C RNA甲基化測序技術(shù)對兩組樣本中的總RNA和胞核RNA進(jìn)行檢測。結果表明，ESC中總RNA 5mC的分布頻率比腦組織的分布頻率更高。研究人員將m5C位點(diǎn)和不同的基因組區域（CDS, 5’-UTR, 3’-UTR等）進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結果表明，總RNA中m5C位點(diǎn)更傾向于分布在轉錄起始位點(diǎn)。腦組織和ESC中，3’-UTR區m5C的分布區別很大，這暗示著(zhù)3’-UTR區的RNA m5C修飾可能與細胞功能和細胞類(lèi)型密切相關(guān)。

圖2. m5C的基因組位置分布

案例3：擬南芥m5C RNA甲基化譜及TRM4B酶對根的影響

原文：Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs

期刊：The Plant Cell 影響因子：8.23

與上篇不同，本研究團隊采用m5C RNA甲基化測序研究擬南芥中m5C甲基化譜，在種子，幼芽，根中發(fā)現了1000多個(gè)特異性的位點(diǎn)。敲低RNA m5C甲基轉移酶TRM4B，造成tRNA穩定性的降低。研究人員還證實(shí)TRM4B突變體的初級根比野生型更短，同時(shí)對氧化的應激反應更敏感。

圖3. 擬南芥種子，幼芽，根中m5C位點(diǎn)