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    上海云序生物科技有限公司
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    021-64878766
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    云序生物

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    market@cloud-seq.com.cn

    上海市松江區莘磚公路518號24號樓4樓

    m5C-BS-seq全轉錄組測序(Spike-In Plus)

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    ×
    m5C RNA是近年來(lái)發(fā)現的一類(lèi)在tRNA及rRNA高豐度存在的甲基化修飾。利用高通量測序手段驗證了非編碼RNA以及部分mRNA中m5C存在,但是在不同物種、不同組織中m5C修飾分布圖譜尚沒(méi)有系統性報道。云序生物率先開(kāi)展m5C RNA甲基化測序服務(wù),采用經(jīng)典重亞硫 酸鹽處理的方式進(jìn)行測序。在全轉錄范圍內及tRNA水平查看基因m5C甲基化修飾水平。
    技術(shù)詳情

    m5C RNA是近年來(lái)發(fā)現的一類(lèi)在tRNA及rRNA高豐度存在的甲基化修飾。5-甲基胞嘧啶(m5C)已在各種物種的代表性生物mRNA、rRNA、tRNA和ncRNA中被發(fā)現。作為一種可逆的表觀(guān)遺傳修飾,RNA m5C修飾影響修飾后的RNA分子命運,并在各種生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用,如RNA穩定性調控、蛋白結合、RNA剪接和核質(zhì)穿梭,DNA損傷修復,擴散和遷移,干細胞發(fā)育、分化和重編程。此外,眾多研究證據也表明RNA m5C在腫瘤發(fā)生中的作用,包括動(dòng)脈硬化、自身免疫性疾病和癌癥。目前,利用高通量測序手段已經(jīng)驗證了非編碼RNA以及部分mRNA中m5C的存在,但在不同物種、不同組織中m5C修飾分布圖譜尚沒(méi)有系統性的報道。

    云序生物率先開(kāi)展m5C-Bis-seq(Bisulfite Sequencing)測序服務(wù),采用經(jīng)典重亞硫酸鹽處理的方式,在全轉錄范圍內及tRNA水平查看基因m5C甲基化修飾水平。實(shí)驗原理:重亞硫酸鹽處理可以作用于未發(fā)生修飾的C堿基,使其在測序時(shí)發(fā)生C→U的轉化,而發(fā)生修飾的m5C堿基不受影響,保持C→C,從而實(shí)現m5C單堿基的識別。同時(shí),在實(shí)驗中還會(huì )添加不帶修飾的陰性spike in,進(jìn)行重亞硫酸鹽處理后堿基轉化的比率(轉化率高達99%以上),從而保證測序中檢測的位點(diǎn)為m5C修飾位點(diǎn)。

    此外,云序生物亦提供 m5C 甲基化免疫沉淀測序(m5C Methylation Immunoprecipitation Sequencing,簡(jiǎn)稱(chēng) m5C MeRIP-seq)服務(wù),助力 m5C 修飾研究。

    m5C-Bis-seq流程圖

    云序生物m5C BiS-seq測序流程

    云序優(yōu)勢

    一站式服務(wù):

    客戶(hù)只需提供組織、細胞、全血樣品或RNA,云序生物為您完成m5C RNA-Seq全套實(shí)驗服務(wù)。

    嚴格的質(zhì)控:

    云序生物對m5C RNA-Seq實(shí)驗每一步驟均設有關(guān)鍵質(zhì)控,保證客戶(hù)得到優(yōu)質(zhì)數據。
    專(zhuān)業(yè)的生物信息學(xué)分析:

    云序生物擁有專(zhuān)業(yè)的生物信息分析團隊,幫助客戶(hù)進(jìn)行實(shí)驗數據的全面挖掘。


    樣本要求

    樣品類(lèi)型:

    細胞、新鮮組織或RNA樣品。其它類(lèi)型樣品請詳詢(xún)。

    樣品量:

    a) 細胞:>2×107

    b) 組織:>200 mg

    c) RNA:2-300 μg(推薦>30μg,OD260/280:1.6-2.3;RNA無(wú)明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7)

    d)全血>5ml (推薦用EDTA 抗凝采血管,不可用肝素抗凝管)

    樣品運輸與保存

    樣品運輸:樣品置于1.5mL離心管中,封口膜封好,干冰運輸。

    樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊(切成5-10 mg的小塊)可用TRIZOL或RNA保護劑處理,液氮凍存后-80℃保存;RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中,-80℃保存,避免反復凍融。


    數據分析(僅供展示,詳見(jiàn)demo報告)

    1、RNA甲基化位點(diǎn)識別及注釋

    云序生物使用meRanCall軟件識別出每個(gè)樣本中的m5C甲基化位點(diǎn),再通過(guò)自有程序挑選出與已知編碼基因的exon重疊的m5C甲基化位點(diǎn)

    2、RNA甲基化位點(diǎn)識別及注釋

    云序生物使用meRanCompare軟件識別兩組RNA Bis-seq樣本中的差異甲基化位點(diǎn)。meRanCompare軟件將差異甲基化位點(diǎn)(DMS)劃分為各組特異性甲基化位點(diǎn)和兩組皆發(fā)生甲基化但甲基化比例不同的位點(diǎn)。默認篩選標準為P value < 0.05(以報告為準)。

    3、差異甲基化基因的GO/KEGG分析

    4、Motif分析

    f5be687d7cc89b90357df69e82c9ac0

    5、Classification分析

    6、Metagene分析

    7、Venn圖

    8、IGV可視化

    1721640237071


    案例分析

    案例1:m5C RNA甲基化調控mRNA出核新機制

    原文:5-methylcytosine promotes mRNA export — NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader

    期刊:Cell Research                        影響因子:15.60

    中科院汪海林等研究團隊揭示了m5C修飾在mRNA的分布圖譜規律及其對調控mRNA出核作用新機制。研究人員建立了改進(jìn)的RNA m5C單堿基分辨率高通量測序與生物信息分析技術(shù),以此揭示mRNA m5C的分布規律,并繪制了精細的m5C修飾圖譜,發(fā)現m5C在mRNA的翻譯起始位點(diǎn)下游有明顯富集,并且主要分布于CG富集區域。通過(guò)分析對比人和小鼠不同組織,發(fā)現m5C在mRNA上的分布特征在哺乳動(dòng)物中十分保守,而在不同組織中修飾的基因具有特異性。研究團隊同時(shí)發(fā)現,在小鼠睪丸發(fā)育過(guò)程中,動(dòng)態(tài)的m5C修飾基因明顯富集于精子發(fā)育相關(guān)功能,提示m5C修飾參與生殖發(fā)育調控。

    mRNA中m5C的分布規律及組織特異性表達

    mRNA中m5C的分布規律及組織特異性表達

    案例2: m5C RNA甲基化基因組分布圖譜

    原文:Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain 

    期刊:Genome Biology                           影響因子:13.21

    近期刊登了解析RNA m5C在不同組織細胞的分布圖譜相關(guān)文章。研究人員選取小鼠胚胎干細胞(ESC)和腦組織(n=3)作為實(shí)驗樣本,利用m5C RNA甲基化測序技術(shù)對兩組樣本中的總RNA和胞核RNA進(jìn)行檢測。結果表明,ESC中總RNA 5mC的分布頻率比腦組織的分布頻率更高。研究人員將m5C位點(diǎn)和不同的基因組區域(CDS, 5’-UTR, 3’-UTR等)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結果表明,總RNA中m5C位點(diǎn)更傾向于分布在轉錄起始位點(diǎn)。腦組織和ESC中,3’-UTR區m5C的分布區別很大,這暗示著(zhù)3’-UTR區的RNA m5C修飾可能與細胞功能和細胞類(lèi)型密切相關(guān)。

    m5C的基因組位置分布

    m5C的基因組位置分布

    案例3:擬南芥m5C RNA甲基化譜及TRM4B酶對根的影響

    原文:Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs

    期刊:The Plant Cell                   影響因子:8.23

    與上篇不同,本研究團隊采用m5C RNA甲基化測序研究擬南芥中m5C甲基化譜,在種子,幼芽,根中發(fā)現了1000多個(gè)特異性的位點(diǎn)。敲低RNA m5C甲基轉移酶TRM4B,造成tRNA穩定性的降低。研究人員還證實(shí)TRM4B突變體的初級根比野生型更短,同時(shí)對氧化的應激反應更敏感。

    擬南芥種子,幼芽,根中m5C位點(diǎn)

    擬南芥種子、幼芽、根中m5C位點(diǎn)



    m5C-BS-seq全轉錄組測序(Spike-In Plus)
    m5C-BS-seq全轉錄組測序(Spike-In Plus)

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    m5C RNA是近年來(lái)發(fā)現的一類(lèi)在tRNA及rRNA高豐度存在的甲基化修飾。5-甲基胞嘧啶(m5C)已在各種物種的代表性生物mRNA、rRNA、tRNA和ncRNA中被發(fā)現。作為一種可逆的表觀(guān)遺傳修飾,RNA m5C修飾影響修飾后的RNA分子命運,并在各種生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用,如RNA穩定性調控、蛋白結合、RNA剪接和核質(zhì)穿梭,DNA損傷修復,擴散和遷移,干細胞發(fā)育、分化和重編程。此外,眾多研究證據也表明RNA m5C在腫瘤發(fā)生中的作用,包括動(dòng)脈硬化、自身免疫性疾病和癌癥。目前,利用高通量測序手段已經(jīng)驗證了非編碼RNA以及部分mRNA中m5C的存在,但在不同物種、不同組織中m5C修飾分布圖譜尚沒(méi)有系統性的報道。

    云序生物率先開(kāi)展m5C-Bis-seq(Bisulfite Sequencing)測序服務(wù),采用經(jīng)典重亞硫酸鹽處理的方式,在全轉錄范圍內及tRNA水平查看基因m5C甲基化修飾水平。實(shí)驗原理:重亞硫酸鹽處理可以作用于未發(fā)生修飾的C堿基,使其在測序時(shí)發(fā)生C→U的轉化,而發(fā)生修飾的m5C堿基不受影響,保持C→C,從而實(shí)現m5C單堿基的識別。同時(shí),在實(shí)驗中還會(huì )添加不帶修飾的陰性spike in,進(jìn)行重亞硫酸鹽處理后堿基轉化的比率(轉化率高達99%以上),從而保證測序中檢測的位點(diǎn)為m5C修飾位點(diǎn)。

    此外,云序生物亦提供 m5C 甲基化免疫沉淀測序(m5C Methylation Immunoprecipitation Sequencing,簡(jiǎn)稱(chēng) m5C MeRIP-seq)服務(wù),助力 m5C 修飾研究。

    m5C-Bis-seq流程圖

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    樣本要求

    樣品類(lèi)型:

    細胞、新鮮組織或RNA樣品。其它類(lèi)型樣品請詳詢(xún)。

    樣品量:

    a) 細胞:>2×107

    b) 組織:>200 mg

    c) RNA:2-300 μg(推薦>30μg,OD260/280:1.6-2.3;RNA無(wú)明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7)

    d)全血>5ml (推薦用EDTA 抗凝采血管,不可用肝素抗凝管)

    樣品運輸與保存

    樣品運輸:樣品置于1.5mL離心管中,封口膜封好,干冰運輸。

    樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊(切成5-10 mg的小塊)可用TRIZOL或RNA保護劑處理,液氮凍存后-80℃保存;RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中,-80℃保存,避免反復凍融。


    數據分析(僅供展示,詳見(jiàn)demo報告)

    1、RNA甲基化位點(diǎn)識別及注釋

    云序生物使用meRanCall軟件識別出每個(gè)樣本中的m5C甲基化位點(diǎn),再通過(guò)自有程序挑選出與已知編碼基因的exon重疊的m5C甲基化位點(diǎn)

    2、RNA甲基化位點(diǎn)識別及注釋

    云序生物使用meRanCompare軟件識別兩組RNA Bis-seq樣本中的差異甲基化位點(diǎn)。meRanCompare軟件將差異甲基化位點(diǎn)(DMS)劃分為各組特異性甲基化位點(diǎn)和兩組皆發(fā)生甲基化但甲基化比例不同的位點(diǎn)。默認篩選標準為P value < 0.05(以報告為準)。

    3、差異甲基化基因的GO/KEGG分析

    4、Motif分析

    f5be687d7cc89b90357df69e82c9ac0

    5、Classification分析

    6、Metagene分析

    7、Venn圖

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    1721640237071


    案例分析

    案例1:m5C RNA甲基化調控mRNA出核新機制

    原文:5-methylcytosine promotes mRNA export — NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader

    期刊:Cell Research                        影響因子:15.60

    中科院汪海林等研究團隊揭示了m5C修飾在mRNA的分布圖譜規律及其對調控mRNA出核作用新機制。研究人員建立了改進(jìn)的RNA m5C單堿基分辨率高通量測序與生物信息分析技術(shù),以此揭示mRNA m5C的分布規律,并繪制了精細的m5C修飾圖譜,發(fā)現m5C在mRNA的翻譯起始位點(diǎn)下游有明顯富集,并且主要分布于CG富集區域。通過(guò)分析對比人和小鼠不同組織,發(fā)現m5C在mRNA上的分布特征在哺乳動(dòng)物中十分保守,而在不同組織中修飾的基因具有特異性。研究團隊同時(shí)發(fā)現,在小鼠睪丸發(fā)育過(guò)程中,動(dòng)態(tài)的m5C修飾基因明顯富集于精子發(fā)育相關(guān)功能,提示m5C修飾參與生殖發(fā)育調控。

    mRNA中m5C的分布規律及組織特異性表達

    mRNA中m5C的分布規律及組織特異性表達

    案例2: m5C RNA甲基化基因組分布圖譜

    原文:Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain 

    期刊:Genome Biology                           影響因子:13.21

    近期刊登了解析RNA m5C在不同組織細胞的分布圖譜相關(guān)文章。研究人員選取小鼠胚胎干細胞(ESC)和腦組織(n=3)作為實(shí)驗樣本,利用m5C RNA甲基化測序技術(shù)對兩組樣本中的總RNA和胞核RNA進(jìn)行檢測。結果表明,ESC中總RNA 5mC的分布頻率比腦組織的分布頻率更高。研究人員將m5C位點(diǎn)和不同的基因組區域(CDS, 5’-UTR, 3’-UTR等)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結果表明,總RNA中m5C位點(diǎn)更傾向于分布在轉錄起始位點(diǎn)。腦組織和ESC中,3’-UTR區m5C的分布區別很大,這暗示著(zhù)3’-UTR區的RNA m5C修飾可能與細胞功能和細胞類(lèi)型密切相關(guān)。

    m5C的基因組位置分布

    m5C的基因組位置分布

    案例3:擬南芥m5C RNA甲基化譜及TRM4B酶對根的影響

    原文:Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs

    期刊:The Plant Cell                   影響因子:8.23

    與上篇不同,本研究團隊采用m5C RNA甲基化測序研究擬南芥中m5C甲基化譜,在種子,幼芽,根中發(fā)現了1000多個(gè)特異性的位點(diǎn)。敲低RNA m5C甲基轉移酶TRM4B,造成tRNA穩定性的降低。研究人員還證實(shí)TRM4B突變體的初級根比野生型更短,同時(shí)對氧化的應激反應更敏感。

    擬南芥種子,幼芽,根中m5C位點(diǎn)

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