m5C RNA是近年來(lái)發(fā)現的一類(lèi)在tRNA及rRNA高豐度存在的甲基化修飾。5-甲基胞嘧啶（m5C）已在各種物種的代表性生物mRNA、rRNA、tRNA和ncRNA中被發(fā)現。作為一種可逆的表觀(guān)遺傳修飾，RNA m5C修飾影響修飾后的RNA分子命運，并在各種生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如RNA穩定性調控、蛋白結合、RNA剪接和核質(zhì)穿梭，DNA損傷修復，擴散和遷移，干細胞發(fā)育、分化和重編程。此外，眾多研究證據也表明RNA m5C在腫瘤發(fā)生中的作用，包括動(dòng)脈硬化、自身免疫性疾病和癌癥。目前，利用高通量測序手段已經(jīng)驗證了非編碼RNA以及部分mRNA中m5C的存在，但在不同物種、不同組織中m5C修飾分布圖譜尚沒(méi)有系統性的報道。

云序生物率先開(kāi)展m5C-Bis-seq（Bisulfite Sequencing）測序服務(wù)，采用經(jīng)典重亞硫酸鹽處理的方式，在全轉錄范圍內及tRNA水平查看基因m5C甲基化修飾水平。實(shí)驗原理：重亞硫酸鹽處理可以作用于未發(fā)生修飾的C堿基，使其在測序時(shí)發(fā)生C→U的轉化，而發(fā)生修飾的m5C堿基不受影響，保持C→C，從而實(shí)現m5C單堿基的識別。同時(shí)，在實(shí)驗中還會(huì )添加不帶修飾的陰性spike in，進(jìn)行重亞硫酸鹽處理后堿基轉化的比率（轉化率高達99%以上），從而保證測序中檢測的位點(diǎn)為m5C修飾位點(diǎn)。

此外，云序生物亦提供 m5C 甲基化免疫沉淀測序（m5C Methylation Immunoprecipitation Sequencing，簡(jiǎn)稱(chēng) m5C MeRIP-seq）服務(wù)，助力 m5C 修飾研究。

云序生物m5C BiS-seq測序流程

云序優(yōu)勢

一站式服務(wù)：

客戶(hù)只需提供組織、細胞、全血樣品或RNA，云序生物為您完成m5C RNA-Seq全套實(shí)驗服務(wù)。

嚴格的質(zhì)控：

云序生物對m5C RNA-Seq實(shí)驗每一步驟均設有關(guān)鍵質(zhì)控，保證客戶(hù)得到優(yōu)質(zhì)數據。
專(zhuān)業(yè)的生物信息學(xué)分析：

云序生物擁有專(zhuān)業(yè)的生物信息分析團隊，幫助客戶(hù)進(jìn)行實(shí)驗數據的全面挖掘。

樣本要求

樣品類(lèi)型：

細胞、新鮮組織或RNA樣品。其它類(lèi)型樣品請詳詢(xún)。

樣品量：

a) 細胞：>2×10⁷

b) 組織：>200 mg

c) RNA：2-300 μg（推薦>30μg，OD260/280：1.6-2.3；RNA無(wú)明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7）

d）全血>5ml （推薦用EDTA 抗凝采血管，不可用肝素抗凝管）

樣品運輸與保存

樣品運輸：樣品置于1.5mL離心管中，封口膜封好，干冰運輸。

樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊（切成5-10 mg的小塊）可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存；RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。

數據分析（僅供展示，詳見(jiàn)demo報告）

1、RNA甲基化位點(diǎn)識別及注釋

云序生物使用meRanCall軟件識別出每個(gè)樣本中的m5C甲基化位點(diǎn)，再通過(guò)自有程序挑選出與已知編碼基因的exon重疊的m5C甲基化位點(diǎn)

2、RNA甲基化位點(diǎn)識別及注釋

云序生物使用meRanCompare軟件識別兩組RNA Bis-seq樣本中的差異甲基化位點(diǎn)。meRanCompare軟件將差異甲基化位點(diǎn)（DMS）劃分為各組特異性甲基化位點(diǎn)和兩組皆發(fā)生甲基化但甲基化比例不同的位點(diǎn)。默認篩選標準為P value < 0.05（以報告為準）。

3、差異甲基化基因的GO/KEGG分析

4、Motif分析

5、Classification分析

6、Metagene分析

7、Venn圖

8、IGV可視化

案例分析

案例1：m5C RNA甲基化調控mRNA出核新機制

原文：5-methylcytosine promotes mRNA export — NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader

期刊：Cell Research                        影響因子：15.60

中科院汪海林等研究團隊揭示了m5C修飾在mRNA的分布圖譜規律及其對調控mRNA出核作用新機制。研究人員建立了改進(jìn)的RNA m5C單堿基分辨率高通量測序與生物信息分析技術(shù)，以此揭示mRNA m5C的分布規律，并繪制了精細的m5C修飾圖譜，發(fā)現m5C在mRNA的翻譯起始位點(diǎn)下游有明顯富集，并且主要分布于CG富集區域。通過(guò)分析對比人和小鼠不同組織，發(fā)現m5C在mRNA上的分布特征在哺乳動(dòng)物中十分保守，而在不同組織中修飾的基因具有特異性。研究團隊同時(shí)發(fā)現，在小鼠睪丸發(fā)育過(guò)程中，動(dòng)態(tài)的m5C修飾基因明顯富集于精子發(fā)育相關(guān)功能，提示m5C修飾參與生殖發(fā)育調控。

mRNA中m5C的分布規律及組織特異性表達

案例2: m5C RNA甲基化基因組分布圖譜

原文：Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain 

期刊：Genome Biology                           影響因子：13.21

近期刊登了解析RNA m5C在不同組織細胞的分布圖譜相關(guān)文章。研究人員選取小鼠胚胎干細胞（ESC）和腦組織（n=3）作為實(shí)驗樣本，利用m5C RNA甲基化測序技術(shù)對兩組樣本中的總RNA和胞核RNA進(jìn)行檢測。結果表明，ESC中總RNA 5mC的分布頻率比腦組織的分布頻率更高。研究人員將m5C位點(diǎn)和不同的基因組區域（CDS, 5’-UTR, 3’-UTR等）進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結果表明，總RNA中m5C位點(diǎn)更傾向于分布在轉錄起始位點(diǎn)。腦組織和ESC中，3’-UTR區m5C的分布區別很大，這暗示著(zhù)3’-UTR區的RNA m5C修飾可能與細胞功能和細胞類(lèi)型密切相關(guān)。

m5C的基因組位置分布

案例3：擬南芥m5C RNA甲基化譜及TRM4B酶對根的影響

原文：Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs

期刊：The Plant Cell                   影響因子：8.23

與上篇不同，本研究團隊采用m5C RNA甲基化測序研究擬南芥中m5C甲基化譜，在種子，幼芽，根中發(fā)現了1000多個(gè)特異性的位點(diǎn)。敲低RNA m5C甲基轉移酶TRM4B，造成tRNA穩定性的降低。研究人員還證實(shí)TRM4B突變體的初級根比野生型更短，同時(shí)對氧化的應激反應更敏感。

擬南芥種子、幼芽、根中m5C位點(diǎn)