GLORI（Glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosine）技術(shù)是針對m6A修飾開(kāi)發(fā)的單堿基檢測技術(shù)。實(shí)現了真正意義的高效率、高靈敏度、高特異性、無(wú)偏好單堿基m6A位點(diǎn)檢測，并對m6A位點(diǎn)的修飾水平進(jìn)行絕對定量。

GLORI技術(shù)原理：

乙二醛和亞硝酸鹽介導的非甲基化腺苷（A）脫氨基測序（GLORI-seq），它能夠對單堿基m6A位點(diǎn)進(jìn)行有效和無(wú)偏倚的檢測，并對m6A修飾水平進(jìn)行絕對定量。在亞硫酸鹽的作用下鳥(niǎo)苷(G)和胞苷(C)也容易發(fā)生脫氨基反應，分別導致G轉化為黃嘌呤(X)和C轉化為尿苷(U)，并且亞硝酸引起G脫氨基的速度遠快于A(yíng)脫氨基，而乙二醛能夠實(shí)現對可逆的對G結構的保護，使其耐受亞硝酸反應。

首先提取總RNA，進(jìn)行片段化，片段化的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)乙二醛和亞硝酸鹽處理，RNA在乙二醛和亞硝酸鹽的催化體系來(lái)有效地將未甲基化的腺苷（Adenosine)脫氨基轉換成形成肌苷（Inosine），肌苷在逆轉錄過(guò)程中與胞苷(Cytidine）配對，在測序過(guò)程中被讀作鳥(niǎo)苷（Guanosine），但m6A保持不變，測序后仍讀為A。因此，GLORI通過(guò)檢測測序序列中A的比例實(shí)現了單堿基分辨。此外，我們在文庫準備過(guò)程中引入了唯一分子識別符(UMI)序列，消除逆轉錄過(guò)程中由擴增效率引起的偏差，實(shí)現m6A的絕對定量。

mA proportion = A/(A+G)

GLORI-seq技術(shù)原理圖

云序技術(shù)優(yōu)勢：

GLORI的技術(shù)核心是不依賴(lài)于抗體，通過(guò)化學(xué)反應組合篩選發(fā)現乙二醛和亞硝酸鹽的催化體系，對未甲基化的腺苷進(jìn)行高效地脫氨從而形成肌苷(A-to-I, > 98%)，肌苷在測序過(guò)程中被讀成鳥(niǎo)苷(G)，形成A-to-G的轉化；而m6A測序后仍被讀成A，從而實(shí)現對m6A的單堿基識別。GLORI通過(guò)檢測測序的讀段序列中A所占的比例，實(shí)現了對單堿基m6A的檢測。

在文庫準備過(guò)程中引入了唯一分子識別符(UMI)序列，消除逆轉錄過(guò)程中由擴增效率引起的偏差，實(shí)現m6A的絕對定量。

盡管當下已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種m6A檢測和測序方法，但是GLORI的技術(shù)相較于基于m6A抗體的檢測方法，能夠得到單堿基檢測。相較于基于限制性?xún)惹忻傅臋z測技術(shù)（只能檢測含有ACA 基序的m6A）實(shí)現對m6A修飾位點(diǎn)的99.9%的檢測，范圍更廣。

樣本要求：

樣品類(lèi)型：

組織、細胞、體液或RNA樣品。其它類(lèi)型樣品請詳詢(xún)。

樣品量：

細胞：2×10⁷

組織：50mg

體液：全血、血清、血漿2-3ml腦脊液：5ml尿液：50ml

總RNA：50μg(OD260/280≥1.8；OD260/230≥1.5;無(wú)明顯降解，電泳檢測樣品特征性條帶完整清晰，無(wú)明顯彌散或拖尾)

樣品運輸及保存

樣品置于1.5mL管中，封口膜封好，干冰運輸。

細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存；血液樣品應使用EDTA抗凝，不可用肝素；RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。