近年來(lái)，科學(xué)家們發(fā)現了一種可逆的RNA甲基化—m6A，即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上發(fā)生甲基化修飾(N6-methyladenosine，m6A)。研究發(fā)現，m6A是真核生物mRNA上常見(jiàn)的一種轉錄后修飾，m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯，以及在細胞分化、胚胎發(fā)育和壓力應答等過(guò)程中起重要作用。

m6A MeRIP-Seq（Methylated RNA Immunoprecipitation，MeRIP）是研究轉錄組表觀(guān)修飾的關(guān)鍵技術(shù)，基于m6A修飾抗體特異性識別并結合m6A修飾RNA的原理，以免疫共沉淀方法富集RNA片段，并配合高通量測序技術(shù)，實(shí)現轉錄組范圍內甲基化的RNA區域的檢測。MeRIP測序技術(shù)技術(shù)成熟、適用于各類(lèi)分子(mRNA,LncRNA,circRNA,pri-miRNA等)。云序生物通過(guò)添加Spike-In實(shí)現更加準確的m6A檢測。

常規的MeRIP實(shí)驗通過(guò)修飾抗體富集修飾RNA，眾所周知，抗體特異性的強弱是決定MeRIP實(shí)驗是否成功的關(guān)鍵，沒(méi)有spike in，將難以確定實(shí)驗是否成功、有效RNA是否富集，也難以確定RNA甲基化修飾的豐度和變化，那么就無(wú)法保證測序結果真實(shí)可靠、質(zhì)量達標。

MeRIP實(shí)驗質(zhì)控金標準 Spike-In

云序生物m6A MeRIP-Seq(Spike-In Plus)測序在實(shí)驗過(guò)程中加入兩類(lèi)人工合成的spike in，分別為陽(yáng)性Spike-In（帶m6A修飾的序列）和陰性Spike-In（不帶修飾的序列），與樣品一起進(jìn)行MeRIP-Seq實(shí)驗，根據spike in的檢測信號對MeRIP實(shí)驗進(jìn)行質(zhì)控，來(lái)確保實(shí)驗流程的準確性、重復性及抗體的特異性。

樣本要求：

樣品類(lèi)型：

細胞、組織或RNA，其他樣本類(lèi)型請電詢(xún)。

樣品量：

a) 細胞：2×10⁷ 

b) 組織：100 mg-1 g

c) RNA：30-300 μg（OD260/280：1.6-2.3；RNA無(wú)明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7）

樣品運輸及保存：

樣品運輸：樣品置于1.5mL離心管中，封口膜封好，干冰運輸。

樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存;RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。

云序數據分析（僅供展示，具體請參考demo報告）

1、甲基化基因識別與注釋

使用MACS檢測樣本信號，根據IP和Input的信號比值，識別基因甲基化區域。

2、差異甲基化基因識別

使用diffReps軟件進(jìn)行差異甲基化位點(diǎn)的識別

3、差異甲基化基因GO分析

4、差異甲基化基因KEGG分析

5、venn圖

6、修飾區域Motif分析

7、修飾位點(diǎn)可視化

8、四象限圖※

案例分析

案例1：擬南芥花葉根組織m6A RNA甲基化譜

原文：Transcriptome-wide high-throughput deep m6 A-seq reveals unique differential m6 A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana

期刊：Genome Biology 影響因子：13.21

西北農林科技大學(xué)聯(lián)合中科院和普渡大學(xué)，借助m6A RNA甲基化測序技術(shù)，對比擬南芥花，葉，根組織中（每種組織有兩個(gè)生物學(xué)重復）m6A RNA甲基化情況。結果發(fā)現檢測組織中m6A RNA甲基化修飾程度比人類(lèi)高10%左右，占轉錄組的83%。

圖1. 比較擬南芥花，葉，根組織中m6A RNA甲基化情況

案例2：不同品系擬南芥m6A RNA甲基化譜 

原文：Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana

期刊：Nature communications 影響因子：12.12

芝加哥大學(xué)聯(lián)合北大，利用m6A RNA甲基化測序對比和品系擬南芥根組織中m6A RNA甲基化譜，發(fā)現的分布在兩個(gè)品種間高度保守。與人類(lèi)m6A RNA甲基化位點(diǎn)分布情況相比，擬南芥甲基化位點(diǎn)在起始翻譯區特異性高表達。

圖2. 不同品系，同一基因上甲基化 

案例3：m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通過(guò)結合lncRNA促進(jìn)膠質(zhì)瘤細胞

原文：m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program 

期刊：Cancer Cell 影響因子：27.43 

世界衛生組織將膠質(zhì)瘤分為四級，其中惡性膠質(zhì)瘤(GBM)屬于極危險的第四級，手術(shù)治 療和化療都難以避免其高復發(fā)率。近年來(lái)，m6A RNA修飾的研究已成為當今生命科學(xué)領(lǐng)域前沿研究之一，不斷有高影響分子文章問(wèn)世。m6A RNA修飾的催化、去除以及識別的分子機理研究越來(lái)越清晰，此時(shí)人們更關(guān)心m6A RNA修飾與重大疾病之間的相關(guān)性。近期Cancer Cell報道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中具有生理作用。在本研究中，去甲基化酶ALKBH5在惡性膠質(zhì)瘤干性樣細胞表達上調，而ALKBH5高表達的膠質(zhì)細胞瘤患者預后生存率更差。通過(guò)敲低ALKBH5，meRIP鑒定m6A RNA甲基化修飾模式，基因芯片檢測差異表達>2倍的基因，終篩選到與細胞周期調控相關(guān)的FOXM1基因，其在GSCs的自我修復和腫 瘤形成中起到關(guān)鍵作用。ALKBH5促使ai基因FOXM1轉錄本去甲基化，增加FOXM1表達。隨后作者發(fā)現FOXM1反義長(cháng)鏈非編碼RNA——FOXM1-AS(LOC100507424)，與FOXM1 mRNA外顯子有457個(gè)核苷酸互補。結果證實(shí)ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協(xié)同作用，發(fā)揮促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤腫 瘤形成作用。 

             圖3. ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協(xié)同作用，促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤腫 瘤形成m6A