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    上海云序生物科技有限公司
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    上海市松江區莘磚公路518號24號樓4樓

    m6A Merip-seq 環(huán)狀RNA測序 (Spike-In Plus)

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    ×
    m6A是真核生物mRNA上常見(jiàn)的一種轉錄后修飾, m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯,在細胞分化、胚胎發(fā)育和壓力應答等過(guò)程中起重要作用。
    技術(shù)詳情

    近年來(lái),科學(xué)家們發(fā)現了一種可逆的RNA甲基化—m6A,即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上發(fā)生甲基化修飾(N6-methyladenosine,m6A)。研究發(fā)現,m6A是真核生物mRNA上常見(jiàn)的一種轉錄后修飾,m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯,以及在細胞分化、胚胎發(fā)育和壓力應答等過(guò)程中起重要作用。

    m6A MeRIP-Seq(Methylated RNA Immunoprecipitation,MeRIP)是研究轉錄組表觀(guān)修飾的關(guān)鍵技術(shù),基于m6A修飾抗體特異性識別并結合m6A修飾RNA的原理,以免疫共沉淀方法富集RNA片段,并配合高通量測序技術(shù),實(shí)現轉錄組范圍內甲基化的RNA區域的檢測。MeRIP測序技術(shù)技術(shù)成熟、適用于各類(lèi)分子(mRNA,LncRNA,circRNA,pri-miRNA等)。云序生物通過(guò)添加Spike-In實(shí)現更加準確的m6A檢測。

    常規的MeRIP實(shí)驗通過(guò)修飾抗體富集修飾RNA,眾所周知,抗體特異性的強弱是決定MeRIP實(shí)驗是否成功的關(guān)鍵,沒(méi)有spike in,將難以確定實(shí)驗是否成功、有效RNA是否富集,也難以確定RNA甲基化修飾的豐度和變化,那么就無(wú)法保證測序結果真實(shí)可靠、質(zhì)量達標。

    MeRIP實(shí)驗質(zhì)控金標準 Spike-In

    云序生物m6A MeRIP-Seq(Spike-In Plus)測序在實(shí)驗過(guò)程中加入兩類(lèi)人工合成的spike in,分別為陽(yáng)性Spike-In(帶m6A修飾的序列)和陰性Spike-In(不帶修飾的序列),與樣品一起進(jìn)行MeRIP-Seq實(shí)驗,根據spike in的檢測信號對MeRIP實(shí)驗進(jìn)行質(zhì)控,來(lái)確保實(shí)驗流程的準確性、重復性及抗體的特異性。

    樣本要求:

    樣品類(lèi)型:

    細胞、組織或RNA,其他樣本類(lèi)型請電詢(xún)。

    樣品量:

    a) 細胞:2×10

    b) 組織:100 mg-1 g

    c) RNA:30-300 μg(OD260/280:1.6-2.3;RNA無(wú)明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7)


    樣品運輸及保存:

    樣品運輸:樣品置于1.5mL離心管中,封口膜封好,干冰運輸。

    樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理,液氮凍存后-80℃保存;RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中,-80℃保存,避免反復凍融。


    云序數據分析(僅供展示,具體請參考demo報告)

    1、甲基化基因識別與注釋

    使用MACS檢測樣本信號,根據IP和Input的信號比值,識別基因甲基化區域。


    2、差異甲基化基因識別

    使用diffReps軟件進(jìn)行差異甲基化位點(diǎn)的識別


    3、差異甲基化基因GO分析


    4、差異甲基化基因KEGG分析

    5、venn圖


    6、修飾區域Motif分析

    7、修飾位點(diǎn)可視化


    8、四象限圖※


    案例分析

    案例1:擬南芥花葉根組織m6A RNA甲基化譜

    原文:Transcriptome-wide high-throughput deep m6 A-seq reveals unique differential m6 A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana

    期刊:Genome Biology 影響因子:13.21

    西北農林科技大學(xué)聯(lián)合中科院和普渡大學(xué),借助m6A RNA甲基化測序技術(shù),對比擬南芥花,葉,根組織中(每種組織有兩個(gè)生物學(xué)重復)m6A RNA甲基化情況。結果發(fā)現檢測組織中m6A RNA甲基化修飾程度比人類(lèi)高10%左右,占轉錄組的83%。



    比較擬南芥花,葉,根組織中m6A RNA甲基化情況

    圖1. 比較擬南芥花,葉,根組織中m6A RNA甲基化情況


    案例2:不同品系擬南芥m6A RNA甲基化譜 

    原文:Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana

    期刊:Nature communications 影響因子:12.12

    芝加哥大學(xué)聯(lián)合北大,利用m6A RNA甲基化測序對比和品系擬南芥根組織中m6A RNA甲基化譜,發(fā)現的分布在兩個(gè)品種間高度保守。與人類(lèi)m6A RNA甲基化位點(diǎn)分布情況相比,擬南芥甲基化位點(diǎn)在起始翻譯區特異性高表達。


      不同品系,同一基因上甲基化

    圖2. 不同品系,同一基因上甲基化 


    案例3:m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通過(guò)結合lncRNA促進(jìn)膠質(zhì)瘤細胞

    原文:m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program 

    期刊:Cancer Cell 影響因子:27.43 

    世界衛生組織將膠質(zhì)瘤分為四級,其中惡性膠質(zhì)瘤(GBM)屬于極危險的第四級,手術(shù)治 療和化療都難以避免其高復發(fā)率。近年來(lái),m6A RNA修飾的研究已成為當今生命科學(xué)領(lǐng)域前沿研究之一,不斷有高影響分子文章問(wèn)世。m6A RNA修飾的催化、去除以及識別的分子機理研究越來(lái)越清晰,此時(shí)人們更關(guān)心m6A RNA修飾與重大疾病之間的相關(guān)性。近期Cancer Cell報道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中具有生理作用。在本研究中,去甲基化酶ALKBH5在惡性膠質(zhì)瘤干性樣細胞表達上調,而ALKBH5高表達的膠質(zhì)細胞瘤患者預后生存率更差。通過(guò)敲低ALKBH5,meRIP鑒定m6A RNA甲基化修飾模式,基因芯片檢測差異表達>2倍的基因,終篩選到與細胞周期調控相關(guān)的FOXM1基因,其在GSCs的自我修復和腫 瘤形成中起到關(guān)鍵作用。ALKBH5促使ai基因FOXM1轉錄本去甲基化,增加FOXM1表達。隨后作者發(fā)現FOXM1反義長(cháng)鏈非編碼RNA——FOXM1-AS(LOC100507424),與FOXM1 mRNA外顯子有457個(gè)核苷酸互補。結果證實(shí)ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協(xié)同作用,發(fā)揮促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤腫 瘤形成作用。 

                  ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協(xié)同作用,促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤腫 瘤形成

                 圖3. ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協(xié)同作用,促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤腫 瘤形成m6A




    m6A Merip-seq 環(huán)狀RNA測序 (Spike-In Plus)
    m6A Merip-seq 環(huán)狀RNA測序 (Spike-In Plus)

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    m6A是真核生物mRNA上常見(jiàn)的一種轉錄后修飾, m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯,在細胞分化、胚胎發(fā)育和壓力應答等過(guò)程中起重要作用。
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    技術(shù)詳情

    近年來(lái),科學(xué)家們發(fā)現了一種可逆的RNA甲基化—m6A,即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上發(fā)生甲基化修飾(N6-methyladenosine,m6A)。研究發(fā)現,m6A是真核生物mRNA上常見(jiàn)的一種轉錄后修飾,m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯,以及在細胞分化、胚胎發(fā)育和壓力應答等過(guò)程中起重要作用。

    m6A MeRIP-Seq(Methylated RNA Immunoprecipitation,MeRIP)是研究轉錄組表觀(guān)修飾的關(guān)鍵技術(shù),基于m6A修飾抗體特異性識別并結合m6A修飾RNA的原理,以免疫共沉淀方法富集RNA片段,并配合高通量測序技術(shù),實(shí)現轉錄組范圍內甲基化的RNA區域的檢測。MeRIP測序技術(shù)技術(shù)成熟、適用于各類(lèi)分子(mRNA,LncRNA,circRNA,pri-miRNA等)。云序生物通過(guò)添加Spike-In實(shí)現更加準確的m6A檢測。

    常規的MeRIP實(shí)驗通過(guò)修飾抗體富集修飾RNA,眾所周知,抗體特異性的強弱是決定MeRIP實(shí)驗是否成功的關(guān)鍵,沒(méi)有spike in,將難以確定實(shí)驗是否成功、有效RNA是否富集,也難以確定RNA甲基化修飾的豐度和變化,那么就無(wú)法保證測序結果真實(shí)可靠、質(zhì)量達標。

    MeRIP實(shí)驗質(zhì)控金標準 Spike-In

    云序生物m6A MeRIP-Seq(Spike-In Plus)測序在實(shí)驗過(guò)程中加入兩類(lèi)人工合成的spike in,分別為陽(yáng)性Spike-In(帶m6A修飾的序列)和陰性Spike-In(不帶修飾的序列),與樣品一起進(jìn)行MeRIP-Seq實(shí)驗,根據spike in的檢測信號對MeRIP實(shí)驗進(jìn)行質(zhì)控,來(lái)確保實(shí)驗流程的準確性、重復性及抗體的特異性。

    樣本要求:

    樣品類(lèi)型:

    細胞、組織或RNA,其他樣本類(lèi)型請電詢(xún)。

    樣品量:

    a) 細胞:2×10

    b) 組織:100 mg-1 g

    c) RNA:30-300 μg(OD260/280:1.6-2.3;RNA無(wú)明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7)


    樣品運輸及保存:

    樣品運輸:樣品置于1.5mL離心管中,封口膜封好,干冰運輸。

    樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理,液氮凍存后-80℃保存;RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中,-80℃保存,避免反復凍融。


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    1、甲基化基因識別與注釋

    使用MACS檢測樣本信號,根據IP和Input的信號比值,識別基因甲基化區域。


    2、差異甲基化基因識別

    使用diffReps軟件進(jìn)行差異甲基化位點(diǎn)的識別


    3、差異甲基化基因GO分析


    4、差異甲基化基因KEGG分析

    5、venn圖


    6、修飾區域Motif分析

    7、修飾位點(diǎn)可視化


    8、四象限圖※


    案例分析

    案例1:擬南芥花葉根組織m6A RNA甲基化譜

    原文:Transcriptome-wide high-throughput deep m6 A-seq reveals unique differential m6 A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana

    期刊:Genome Biology 影響因子:13.21

    西北農林科技大學(xué)聯(lián)合中科院和普渡大學(xué),借助m6A RNA甲基化測序技術(shù),對比擬南芥花,葉,根組織中(每種組織有兩個(gè)生物學(xué)重復)m6A RNA甲基化情況。結果發(fā)現檢測組織中m6A RNA甲基化修飾程度比人類(lèi)高10%左右,占轉錄組的83%。



    比較擬南芥花,葉,根組織中m6A RNA甲基化情況

    圖1. 比較擬南芥花,葉,根組織中m6A RNA甲基化情況


    案例2:不同品系擬南芥m6A RNA甲基化譜 

    原文:Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana

    期刊:Nature communications 影響因子:12.12

    芝加哥大學(xué)聯(lián)合北大,利用m6A RNA甲基化測序對比和品系擬南芥根組織中m6A RNA甲基化譜,發(fā)現的分布在兩個(gè)品種間高度保守。與人類(lèi)m6A RNA甲基化位點(diǎn)分布情況相比,擬南芥甲基化位點(diǎn)在起始翻譯區特異性高表達。


      不同品系,同一基因上甲基化

    圖2. 不同品系,同一基因上甲基化 


    案例3:m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通過(guò)結合lncRNA促進(jìn)膠質(zhì)瘤細胞

    原文:m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program 

    期刊:Cancer Cell 影響因子:27.43 

    世界衛生組織將膠質(zhì)瘤分為四級,其中惡性膠質(zhì)瘤(GBM)屬于極危險的第四級,手術(shù)治 療和化療都難以避免其高復發(fā)率。近年來(lái),m6A RNA修飾的研究已成為當今生命科學(xué)領(lǐng)域前沿研究之一,不斷有高影響分子文章問(wèn)世。m6A RNA修飾的催化、去除以及識別的分子機理研究越來(lái)越清晰,此時(shí)人們更關(guān)心m6A RNA修飾與重大疾病之間的相關(guān)性。近期Cancer Cell報道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中具有生理作用。在本研究中,去甲基化酶ALKBH5在惡性膠質(zhì)瘤干性樣細胞表達上調,而ALKBH5高表達的膠質(zhì)細胞瘤患者預后生存率更差。通過(guò)敲低ALKBH5,meRIP鑒定m6A RNA甲基化修飾模式,基因芯片檢測差異表達>2倍的基因,終篩選到與細胞周期調控相關(guān)的FOXM1基因,其在GSCs的自我修復和腫 瘤形成中起到關(guān)鍵作用。ALKBH5促使ai基因FOXM1轉錄本去甲基化,增加FOXM1表達。隨后作者發(fā)現FOXM1反義長(cháng)鏈非編碼RNA——FOXM1-AS(LOC100507424),與FOXM1 mRNA外顯子有457個(gè)核苷酸互補。結果證實(shí)ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協(xié)同作用,發(fā)揮促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤腫 瘤形成作用。 

                  ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協(xié)同作用,促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤腫 瘤形成

                 圖3. ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協(xié)同作用,促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤腫 瘤形成m6A




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