m6A+單細胞熱點(diǎn)專(zhuān)題二：YTHDF2通過(guò)CD8+T細胞調控TAM重編程并控制抗腫瘤免疫

m6A修飾與腫瘤發(fā)生、增殖、分化、腫瘤侵襲及轉移息息相關(guān)。近年來(lái)，關(guān)于腫瘤浸潤的髓系細胞（TIMs）中的m6A修飾在塑造腫瘤免疫和免疫治療中發(fā)揮作用的研究較多，但在腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）中的效應機制尚未闡明。YTHDF2是一種m6A閱讀蛋白，可以介導m6A修飾的mRNA的代謝，包括調控靶mRNA的翻譯與穩定性等。本文作者闡述了YTHDF2調節TAM的抗腫瘤功能，發(fā)現YTHDF2能夠通過(guò)CD8+T細胞調控TAM重編程并控制抗腫瘤免疫。

m6A修飾分析可以揭示RNA分子的修飾狀態(tài)，而單細胞測序則可以揭示具體細胞類(lèi)型的基因表達狀態(tài)。通過(guò)聯(lián)合分析，可以定位到具體細胞類(lèi)群，鎖定關(guān)鍵調控因子，從而更精確地理解細胞的功能和狀態(tài)。此外，這種聯(lián)合分析還有助于揭示細胞間的異質(zhì)性，尤其是在復雜的組織或疾病樣本中。例如，在腫瘤微環(huán)境中，不同類(lèi)型的細胞可能具有不同的m6A修飾模式，這些模式可能與其在腫瘤發(fā)展中的角色有關(guān)。通過(guò)單細胞測序，可以識別這些細胞類(lèi)型，并通過(guò)m6A修飾分析了解它們的功能差異。云序生物可提供該研究中scRNA-seq、 m6A MeRIP-seq、 RNA-seq、  RIP-seq等服務(wù)，歡迎老師們線(xiàn)下線(xiàn)上咨詢(xún)！

標題： YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells

發(fā)表時(shí)間：2023.1.19

發(fā)表期刊：nature immunology

影響因子：27.7/Q1

樣品類(lèi)型：Ythdf2cKO小鼠；B16F10細胞系等

研究方法：scRNA-seq、 m6A MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-seq 、Chip-qpcr、 MeRIP-qPCR （云序均可提供）

研究摘要

腫瘤微環(huán)境（TME）是一個(gè)復雜的系統，惡性細胞與免疫細胞、非免疫細胞單獨或聯(lián)合相互作用，從而影響免疫治療過(guò)程。腫瘤招募和/或重塑髓系細胞到腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）、樹(shù)突狀細胞（DCs）等以觸發(fā)免疫環(huán)境抑制。腫瘤浸潤性髓系細胞（TIMs）能夠直接刺激腫瘤細胞增殖，加快腫瘤發(fā)展進(jìn)程。但有些類(lèi)型的TIMs如TAMs， 則具有抑制腫瘤的功能，是TME中腫瘤相關(guān)免疫抑制的有效調節因子。m6 A是最常見(jiàn)的RNA甲基化類(lèi)型，其在塑造腫瘤免疫和免疫治療中具有重要作用，m6 A閱讀蛋白在TAMs中的作用可能為免疫治療提供新思路。在這里，作者證明了N6 -甲基腺嘌呤閱讀器YTHDF2調節TAMs的抗腫瘤功能。TAMs中YTHDF2的缺失通過(guò)重編程TAMs向抗腫瘤表型轉化并增強其抗原交叉提呈能力來(lái)抑制腫瘤生長(cháng)，進(jìn)而增強CD8 + T細胞介導的抗腫瘤免疫。YTHDF2缺失通過(guò)靶向干擾素- γ - STAT1信號促進(jìn)TAMs重編程。TAMs中YTHDF2的表達受白細胞介素- 10 - STAT3信號調控。利用Toll樣受體9激動(dòng)劑偶聯(lián)的sm選擇性靶向TAMs中的YTHDF2

技術(shù)路線(xiàn)

研究結果

1、YTHDF2在TIMs中表達上調

作者從癌癥基因組圖譜( TCGA )數據庫和基因型-組織表達( GTEx )數據庫的RNA測序( RNA-seq )結果中篩選出YTHDF2在腫瘤樣本和癌旁正常組織中的表達情況。YTHDF2 mRNA在乳腺癌( BRCA )、結腸腺癌( COAD )、膠質(zhì)母細胞瘤( GBM )、直腸腺癌( READ )、皮膚皮膚黑色素瘤( SKCM )和子宮體內膜癌( ( UCEC )等31種腫瘤組織中的14種組織中表達顯著(zhù)上調，與先前報道的一致。利用表達數據( ESTIMATE )算法23對惡性腫瘤組織中基質(zhì)細胞和免疫細胞的估計，發(fā)現在BRCA、GBM、READ、SKCM中，YTHDF2 mRNA的表達與免疫評分呈負相關(guān)。

2、TAMs中YTHDF2缺失抑制腫瘤生長(cháng)和轉移

為了探討YTHDF2在腫瘤發(fā)展中的作用，作者構建了Ythdf2f/f（對照）和Ythdf2cKO（YTHDF2缺失）小鼠模型，并將B16-OVA黑色素瘤細胞、MC38結直腸癌細胞分別皮下注射到Ythdf2f/f、Ythdf2cKO、小鼠中，發(fā)現與Ythdf2f/f小鼠相比，Ythdf2cKO小鼠的腫瘤體積和重量顯著(zhù)減少（圖1a、b）。此外，在一個(gè)黑色素瘤肺轉移模型中，Ythdf2cKO小鼠的轉移性結節負擔低于Ythdf2f/f小鼠（圖1c），且Ythdf2cKO小鼠的存活時(shí)間明顯長(cháng)于Ythdf2f/f小鼠（圖1d）。而后，作者進(jìn)一步觀(guān)察到Ythdf2cKO小鼠中的CD11b+ F4/80+巨噬細胞數量顯著(zhù)增加（圖1e、f），并且，加入巨噬細胞清除劑氯膦酸二鈉脂質(zhì)體（clodronate liposomes）后，YTHDF2缺失導致的腫瘤抑制作用被消除（圖1g）。此外，作者在Ythdf2f/f和Ythdf2cKO小鼠中共接種了骨髓源性巨噬細胞（BMDMs），發(fā)現Ythdf2cKO BMDMs小鼠中的腫瘤生長(cháng)速度顯著(zhù)低于Ythdf2f/f BMDMs小鼠（圖1h、i）。以上結果說(shuō)明，TAMs中YTHDF2缺失抑制了小鼠腫瘤的生長(cháng)和轉移。

圖1 .巨噬細胞中YTHDF2缺失抑制腫瘤生長(cháng)。

a b ：Ythdf2f / f和Ythdf2c KO小鼠(每組n = 5)接種腫瘤后第15天，B16-OVA ( a )或MC38 ( b )腫瘤生長(cháng)和腫瘤重量。

c d ：在Ythdf2f / f和Ythdf2cKO小鼠尾靜脈注射B16F10黑色素瘤細胞后第14天，B16F10肺轉移灶( c ; n = 5)，小鼠存活( d ; n = 12)。

e f : 在B16 - OVA ( e )或MC38 ( f )腫瘤接種( n = 5)后第14天，Ythdf2f / f和Ythdf2cKO小鼠TAMs的代表圖、百分比和絕對數

g :用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體或PBS脂質(zhì)體( Ythdf2f / f + PBS脂質(zhì)體, n = 6 ; Ythdf2c KO + PBS脂質(zhì)體, n = 5 ; Ythdf2c KO +氯膦酸二鈉脂質(zhì)體, n = 4)處理Ythdf2f / f和Ythdf2c KO小鼠B16 - OVA腫瘤生長(cháng)。

h i :接種Ythdf2f / f或Ythdf2c KO BMDMs的免疫活性CD45.1受體小鼠，在腫瘤接種后第15天，B16-OVA ( h ; n = 6)或MC38 ( i ; n = 4)腫瘤生長(cháng)。數據以均數±標準差( mean ± s.d. )表示，采用混合效應模型進(jìn)行雙因素方差分析，隨后進(jìn)行Holm -  d á k post test ( a左, b左, g , h和i)或非成對的雙尾的t-test ( a右, b右, c , e和f)或Kaplan - Meier生存分析和log - rank檢驗( d ) a - h中的數據代表了至少兩個(gè)獨立的實(shí)驗；Ns，不顯著(zhù)。

3、TAMs中YTHDF2缺失增強CD8 + T細胞抗腫瘤反應

作者繼續探究了YTHDF2對T細胞的影響，發(fā)現Ythdf2cKO小鼠中的IFNγ+  CD8+ T細胞、TEM 、TCM、 TN  CD8+ T細胞，SIINFEKL-specific  CD8+ T細胞以及KSPWFTTL-specific CD8+ T細胞的百分比都顯著(zhù)高于Ythdf2f/f小鼠（圖2a-f）。并且，加入CD8抗體，消耗掉CD8+ T細胞后，Ythdf2cKO小鼠的抗腫瘤作用消失。隨后，作者在Ythdf2f/f  BMDMs和Ythdf2cKO  BMDMs小鼠中接種OT-I T細胞，觀(guān)察到Ythdf2cKO BMDMs小鼠的腫瘤體積顯著(zhù)減小。這些數據表明，CD8+ T細胞是YTHDF2缺乏導致的抗腫瘤作用所必須的。

圖2 YTHDF2缺失增強CD8 + T細胞介導的抗腫瘤免疫。

a b:在B16 - OVA ( a )或MC38 ( b )腫瘤接種( n = 5)后第14天，Ythdf2f / f和Ythdf2cKO小鼠腫瘤浸潤產(chǎn)生IFN γ的CD8 + T細胞的代表圖和百分比。

c d:在B16 - OVA ( c )或MC38 ( d )腫瘤接種( n = 5)后第14天，Ythdf2f / f和Ythdf2cKO小鼠腫瘤浸潤效應記憶( TEM )、中央記憶( TCM )和幼稚( TN ) CD8 + T細胞的代表性圖和百分比。

e f：B16-OVA ( e )或MC38 ( f )腫瘤接種( n = 5)后第14天，Ythdf2f / f和Ythdf2c KO小鼠SIINFEKL特異性CD8 + T細胞( e )或KSPWFTTL特異性CD8 + T細胞( f )的代表性圖和百分比。

g: B16 - OVA腫瘤接種后第14天，Ythdf2f / f和Ythdf2c KO小鼠引流淋巴結中產(chǎn)生IFN γ的CD8 + T細胞。細胞因子水平以3 × 105個(gè)引流淋巴結細胞( n = 6)中斑點(diǎn)形成細胞數表示。

h: Ig G或CD8抗體( Ab ; Ythdf2f / f + IgG , n = 6 ; Ythdf2c KO + Ig G , n = 6 ; Ythdf2f / f + CD8Ab , n = 5 ; Ythdf2c KO + CD8 Ab , n = 5)處理的Ythdf2f / f和Ythdf2c KO小鼠接種腫瘤后第18天，B16 - OVA腫瘤生長(cháng)。

i 將Ythdf2f / f和Ythdf2c KO小鼠BMDMs接種于Rag1 - / -小鼠皮下，于腫瘤接種后第21天觀(guān)察B16 - OVA腫瘤生長(cháng)情況，同時(shí)尾靜脈注射OT - I小鼠( Ythdf2f / f BMDMs + OT-I , n = 4 ; Ythdf2c KO BMDMs + OT-I , n = 5)的CD8 + T細胞。

數據以均數±標準差( mean ± s.d. )表示，采用混合效應模型的雙因素方差分析，并經(jīng)Holm -dákpost test ( h和i)或非配對雙尾t檢驗( a-g )校正。a - i中的數據代表至少兩個(gè)獨立的實(shí)驗。

4、YTHDF2 缺乏可改善巨噬細胞的抗腫瘤極化能力

隨后，作者從Ythdf2f/f和Ythdf2cKO小鼠B16-OVA腫瘤中分離出CD45+細胞進(jìn)行了scRNA-seq，利用t-SNE算法進(jìn)行無(wú)監督聚類(lèi)分析，識別出15個(gè)具有獨特表達特征的細胞簇，包括三個(gè)單核/巨噬細胞群，兩個(gè)CD8+ T細胞群等（圖3a、b）。scRNA-seq和qPCR結果共同反映，Ythdf2cKO小鼠中促腫瘤巨噬細胞的比例及其相關(guān)基因表達量顯著(zhù)低于Ythdf2f/f小鼠，而抗腫瘤巨噬細胞比例及其相關(guān)基因表達則呈現相反趨勢（圖3c-g）。此外，流式分析結果與以上實(shí)驗結果一致。由此說(shuō)明，巨噬細胞中YTHDF2的缺失誘導了TAMs中的抗腫瘤程序。

圖3 | YTHDF2缺失通過(guò)促進(jìn)抗腫瘤巨噬細胞極化重編程TAMs。

a :scRNA - seq數據的t - SNE圖顯示，在B16 - OVA腫瘤接種后第14天，從Ythdf2f / f和Ythdf2cKO小鼠中分選出15個(gè)CD45 +腫瘤浸潤免疫細胞簇；mac，巨噬細胞；PDC，漿細胞樣DC

b : 從scRNA - seq數據中指定的15個(gè)細胞簇的基因表達熱圖，如a .每列組為一個(gè)單元格，每行代表一個(gè)基因。對每個(gè)簇的5個(gè)代表性標記基因進(jìn)行標記

c d :sc RNA - seq數據中抗腫瘤和促腫瘤巨噬細胞的T - SNE圖( c )和比例( d )，如a所示。

e :點(diǎn)圖顯示抗腫瘤和促腫瘤巨噬細胞的代表性標志基因的表達，如a . Dot size表示表達該基因的細胞百分比，color intensity表示基因的相對表達水平。

f g :QPCR顯示從B16 - OVA荷瘤的Ythdf2f / f和Ythdf2cKO小鼠腫瘤中分離的CD11b + F4 / 80 + TAMs中抗腫瘤巨噬細胞相關(guān)基因( f ; Nos2、Il1b、Il6、Il12、Il15和Il18 ; n = 4)或促腫瘤巨噬細胞相關(guān)基因( g ; Arg1、Mrc1、Ym1、Il10 ; n = 4)的mRNA表達。

h i :B16-OVA-Ythdf2f / f和Ythdf2c KO小鼠腫瘤中CD11b + F4 / 80 + iNOS +抗腫瘤巨噬細胞( h ; n = 6)或CD11b + F4 / 80 + Arg1 +促腫瘤巨噬細胞( i ; n = 6)的代表性柱狀圖和百分比。數據以均數±標準差表示，采用非配對雙尾t檢驗( f-i )進(jìn)行分析。fi中的數據代表至少兩個(gè)獨立的實(shí)驗。

5、YTHDF2調節巨噬細胞的抗原交叉呈遞

巨噬細胞不僅可以通過(guò)分泌促炎細胞因子促進(jìn)T細胞介導的抗腫瘤反應，還可以通過(guò)將主要組織相容性復合體I類(lèi)( MHCⅠ類(lèi))和MHC II類(lèi)上的腫瘤抗原分別呈遞給CD8 +和CD4 + T細胞。作者發(fā)現Ythdf2c KO小鼠中存在更高的B16-OVA腫瘤浸潤效應CD8+ T細胞（CD8+ Teff），并且，TEA、TC/E、TM、TMP  CD8+ T 細胞富集程度更顯著(zhù)（圖4a、b）。以上表明YTHDF2缺陷的巨噬細胞與TME中CD8+ T細胞的激活和效應功能相關(guān)。作者進(jìn)一步通過(guò)cell phoneDB分析，發(fā)現Ythdf2cKO抗腫瘤巨噬細胞和CD8+ Teff細胞之間的相互作用與MHC I交叉呈現、白細胞招募和T細胞活化密切相關(guān)（圖4c-e）。流式分析結果顯示，H-2Kb -SIINFEKL復合物在Ythdf2cKO小鼠中高表達。此外，體外抗原呈遞試驗表明Ythdf2cKO抗腫瘤BMDMs或TAMs分離得到的SIINFEKL肽和OVA蛋白在Ythdf2cKO小鼠中表達占比更高（圖4g-j）。以上實(shí)驗表明YTHDF2缺陷的巨噬細胞具有增強的抗原交叉呈遞和CD8+ T細胞活化能力。

圖4 | YTHDF2缺失增強了抗腫瘤巨噬細胞的抗原交叉遞呈能力。

a :玫瑰圖顯示Ythdf2f / f和Ythdf2cKO小鼠中15種細胞類(lèi)型的比例

b :Violin圖顯示Ythdf2f / f和Ythdf2c KO小鼠在B16 - OVA腫瘤接種后第14天CD45 +腫瘤浸潤免疫細胞的sc RNA - seq數據中富集了早期活化( TEA )、細胞因子/效應物( TC / E )、記憶( TM )和記憶前體( TMP ) CD8 + T細胞的標記。橫線(xiàn)表示中位值，方框表示第一和第三四分位數。采用雙側Wilcoxon秩和檢驗計算P值。

c :點(diǎn)圖顯示了抗腫瘤細胞和CD8 + Teff細胞所選擇的配體-受體對的平均強度。Dot size表示平均強度水平，color表示置換檢驗計算的P值。

d :在scRNA - seq中，Ythdf2f / f和Ythdf2cKO小鼠抗腫瘤巨噬細胞中MHCⅠ類(lèi)基因標簽富集分數的經(jīng)驗累積分布函數( ECDF )圖。數據采用雙側非配對Wilcoxon檢驗。

e : 在scRNA - seq中，點(diǎn)圖顯示了Ythdf2f / f和Ythdf2cKO小鼠抗腫瘤巨噬細胞中MHC I類(lèi)提呈信號中所選基因的表達特征。Dot size表示表達該基因的細胞百分比，color intensity表示基因的相對表達水平。

f : B16 - OVA腫瘤接種( n = 3)后第14天，Ythdf2f / f和Ythdf2cKO小鼠腫瘤組織中H - 2Kb SIINFEKL陽(yáng)性的抗腫瘤或促腫瘤巨噬細胞的代表性直方圖和百分比

g h i j: 與SIINFEKEL肽段( g和i)或負載( h和j)的OVA蛋白的抗腫瘤BMDMs ( g , n = 3 ; h , n = 4)或B16 - OVA荷瘤小鼠分離的CD11b + F4 / 80 + TAMs在B16 - OVA腫瘤接種( i , n = 3 ; j , n = 3)后第14天共培養產(chǎn)生IFN γ的OT - I CD8 + T細胞的代表性圖和百分比

k : qPCR檢測B16 - OVA腫瘤接種( n = 3)后第14天Ythdf2f / f和Ythdf2cKO小鼠CD11b + F4 / 80 +巨噬細胞中Ifng4和Ifnb1的表達。

數據代表至少三個(gè)獨立的實(shí)驗，以平均值±標準差表示，并通過(guò)非配對雙尾t檢驗進(jìn)行分析( f-k )。

6、缺乏 YTHDF2 可通過(guò) IFNγ-STAT1 信號對巨噬細胞進(jìn)行重編程

作者使用scRNA-seq數據進(jìn)行GSEA分析，發(fā)現富集到IFNγ response通路并且該通路相關(guān)基因在Ythdf2cKO抗腫瘤巨噬細胞中高表達（圖5a-c）。WB實(shí)驗表明Ythdf2cKO BMDMs中Stat1磷酸化水平更高。而后，作者在Ythdf2f/f BMDMs和 Ythdf2cKO BMDMs中敲低了Stat1，發(fā)現敲低Stat1后，IFNγ下游的抗腫瘤巨噬細胞特征基因Il15 和Cxcl9在兩種細胞中的表達差異被消除。并且，在加入IFNγ抗體后，Ythdf2f/f BMDMs的抗腫瘤作用被抑制（圖5i）。以上結果表明，YTHDF2通過(guò)IFNγ-STAT1信號通路調控巨噬細胞重編程。

圖5 | YTHDF2缺失通過(guò)IFN γ - STAT1信號傳導驅動(dòng)抗腫瘤巨噬細胞極化。

a :與GSEA來(lái)源的Ythdf2f / f巨噬細胞相比，Ythdf2c KO抗腫瘤巨噬細胞中Top 6富集的通路。

b : 與Ythdf2f / f小鼠相比，Ythdf2cKO小鼠抗腫瘤巨噬細胞中IFN γ反應的富集；NES，標準化富集得分；FDR，錯誤發(fā)現率。

c :火山圖顯示Ythdf2f / f小鼠和Ythdf2cKO小鼠抗腫瘤巨噬細胞之間的DEGs。以絕對對數轉換倍數變化> 0.25且調整后的P值< 0.05 (通過(guò)雙側Wilcoxon秩和檢驗確定,并使用Bonferroni校正進(jìn)行校正)的DEGs (差異表達基因)定義為顯著(zhù)。

d :免疫印跡檢測IFN γ處理的Ythdf2f / f和Ythdf2c KO小鼠BMDM中STAT1磷酸化( pSTAT1 )。

e : qPCR檢測轉染Stat1 siRNA或對照siRNA ( n = 3)的抗腫瘤巨噬細胞中Il15和Cxcl9 mRNA的表達

f : 將Ythdf2f / f或Ythdf2c KO小鼠( n = 5)來(lái)源的Stat1敲低( siRNAStat1 )或對照( siRNACtr ) BMDMs移植入免疫正常C57BL / 6小鼠，于腫瘤接種后第15天觀(guān)察B16 - OVA腫瘤生長(cháng)情況。

g :將Ythdf2f / f或Ythdf2c KO小鼠( n = 5)來(lái)源的Stat1敲除( gRNAStat1 )或對照( gRNACtr ) BMDMs移植入免疫正常C57BL / 6小鼠，腫瘤接種后第15天B16 - OVA腫瘤生長(cháng)；GRNA，向導RNA

h :用Ig G或IFN γ抗體( Ythdf2f / f + IgG , n = 5 ; Ythdf2c KO + IFN γ抗體, n = 5 ; Ythdf2c KO + Ig G , n = 4)處理的Ythdf2f / f和Ythdf2c KO小鼠接種腫瘤后第15天，B16 - OVA腫瘤生長(cháng)。

i :將Ythdf2c KO小鼠( n = 5)的Ifngr1基因敲除BMDMs ( gRNAIfngr1 )或Ythdf2f / f或Ythdf2c KO小鼠( n = 5)的對照BMDMs ( gRNACtr )移植免疫正常C57BL / 6小鼠，于腫瘤接種后第13天觀(guān)察B16 - OVA腫瘤生長(cháng)情況。

數據以均數±標準差表示，采用單因素方差分析( One-way ANOVA with a Holm-dák post test，e )或兩因素方差分析( Two-way ANOVA with mixed-effect model after a Holm-dák post test，f-i )。d-i中的數據代表至少兩個(gè)獨立的實(shí)驗。

7、YTHDF2降低了巨噬細胞中Stat1 mRNA的穩定性

作者使用Ythdf2f/f BMDMs和Ythdf2cKO BMDMs進(jìn)行了m6A MeRIP-seq，在兩組中均有檢測到m6A經(jīng)典motif GGAC，m6A peak 主要分布在CDS、3’UTR區和終止密碼子附近（補充材料圖6a-c）。GSEA分析顯示富集到IFNγ response等通路，參與多條促炎通路的基因如Stat1、Tlr4等表達上調，且近一半的上調基因帶有m6A修飾（補充材料圖6e-g）。隨后，作者再進(jìn)行了YTHDF2 RIP-seq，IGV峰形圖顯示YTHDF2與Stat1的結合peak和m6A peak位置重合（圖6a），在Stat1的3UTR區域有2個(gè)m6A修飾位點(diǎn)（圖6b）。通過(guò)m6A MeRIP-qPCR和RIP-qpcr實(shí)驗驗證（圖6c、d），再次說(shuō)明了3’UTR中的兩個(gè)Stat1位點(diǎn)被m6 A甲基化，并與YTHDF2存在相互作用。mRNA穩定性測定顯示（圖6e），與Ythdf2f/f BMDMs相比，Ythdf2cKO BMDMs中Stat1 mRNA的半衰期增加。此外，作者通過(guò)雙熒光素酶報告實(shí)驗對2個(gè)m6A位點(diǎn)進(jìn)行突變（圖6f），結果顯示野生型Ythdf2cKO BMDMs的熒光強度顯著(zhù)高于野生型Ythdf2f/f BMDMs，而突變型樣本之間無(wú)差異。綜上所述，YTHDF2以m6A依賴(lài)性方式降低巨噬細胞中Stat1 mRNA的穩定性。

圖6 | YTHDF2降低巨噬細胞中Stat1 mRNA的穩定性。

a: Integrated Genomics Viewer跟蹤顯示m6A峰和YTHDF2結合峰在Stat1轉錄本中的分布。

b :Stat1 3′UTR內m6A位置和突變的示意圖；Mut，突變體；chr，染色體。

c d : 使用m6A ( c ; n = 3)抗體或YTHDF2抗體進(jìn)行RIP ( d ; n = 3)在抗腫瘤巨噬細胞中的q PCR結果顯示，3′UTR區域的2個(gè)Stat1位點(diǎn)發(fā)生m6A甲基化，并富集到YTHDF2結合位點(diǎn)。兔IgG作為對照。指示基因的富集被標準化到輸入水平。

e :Ythdf2f / f和Ythdf2c KO小鼠抗腫瘤巨噬細胞Stat1轉錄本的mRNA半衰期( t1 / 2 )。在考慮時(shí)間和組別交互作用的線(xiàn)性回歸模型框架下，采用t檢驗對兩組的斜率進(jìn)行比較。

f : pmir GLO-3′UTR-WT，pmir GLO-3′UTR-Mut-1，pmir GLO-3′UTR-Mut-2，pmir GLO-3′UTR-Mut-1 + pmir GLO-3′UTR-Mut-2，Ythdf2f / f和Ythdf2c KO BMDMs ( n = 3)的螢火蟲(chóng)熒光素酶( F-Luc ) /海腎熒光素酶( R-Luc )相對活性。

數據以均數±標準差表示，采用非配對雙尾t檢驗( c , d和f)進(jìn)行分析。c，d，e和f中的數據代表了至少兩個(gè)獨立的實(shí)驗。

8、YTHDF2是腫瘤免疫治療的治療靶點(diǎn)

雖然到目前為止還沒(méi)有YTHDF2的小分子抑制劑，但使用基于寡核苷酸的治療方法，如siRNA，基因沉默顯示出對癌癥和其他疾病的治療前景。作者將Ythdf2 siRNA偶聯(lián)到用Cy3染料標記的單鏈CpG1668 ODN（TLR9激活劑）上，后將CpG–siRNAYthdf2 注射到帶有B16-OVA或MC38腫瘤的小鼠體內，同時(shí)設置對照CpG–siRNACtrl 。結果發(fā)現，CpG–siRNAYthdf2 小鼠的腫瘤生長(cháng)受到顯著(zhù)抑制，并且IFNγ CD8+ T細胞比例明顯高于CpG–siRNACtrl（圖7a、b）。此外，聯(lián)合使用CpG-siRNAYthdf2和pd-L1抗體的抗腫瘤效果更佳（圖7c）。最后，作者也在其他腫瘤組織，如結腸癌或肺癌組織中驗證了YTHDF2的抗腫瘤作用（圖7e、f）。以上結果表明，YTHDF2可能是癌癥免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

圖7 TLR9靶向沉默TAMs中YTHDF2可抑制腫瘤生長(cháng)，聯(lián)合抗PD - L1效果更佳。

a：B16-OVA (左; n = 5)或MC38 (對; n = 5)小鼠在第- 7天腫瘤接種后7、9、11、13天腹腔注射CpGsiRNAYthdf2、CpG - siRNACtrl、CpG或PBS。第8天的數據用于統計分析。

b：在B16 - OVA ( n = 5)或MC38腫瘤模型( PBS , n = 5 ; CpG , n = 3 ; CpG-siRNACtrl , n = 3 ; CpGsiRNAYthdf2 , n = 3)中，第8天腫瘤浸潤的產(chǎn)生IFN γ的CD8 + T細胞百分比，如a所示。

c ：CpG - siRNAYthdf2、CpG - siRNACtrl或聯(lián)合anti - PD - L1 (左; CpG-siRNACtrl + IgG , n = 5 ; CpG-siRNAYthdf2 + IgG , n = 5 ; CpG-siRNACtrl + PD - L1抗體, n = 6 ; siRNAYthdf2 + PD - L1抗體, n = 6)治療小鼠B16 - OVA腫瘤生長(cháng)和腫瘤浸潤產(chǎn)生IFN γ的CD8 + T細胞百分比(對; CpG-siRNACtrl + IgG , n = 5 ; CpGsiRNAYthdf2 + IgG , n = 3 ; CpG-siRNACtrl + PD - L1抗體, n = 5 ; siRNAYthdf2 + PD - L1抗體, n = 3)。CpG - siRNACtrl和CpG - siRNAYthdf2處理同a，PD - L1抗體注射在第- 7天和第0天。第8天的數據用于數據統計

d ：Ly95 T細胞與野生型( WT )或NY - ESO157 - C165肽段( n = 5)預加載的YTHDF2 - / - MDMs共培養時(shí)IFN γ和顆粒酶B表達的代表性圖和百分比；MFI，中位熒光強度。

e ：對COAD患者的腫瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅( Hematoxylin and eosin，H & E )染色和YTHDF2 (黃色) + CD68 (紫色)或CD8 (棕色)的免疫組織化學(xué)染色。虛線(xiàn)勾畫(huà)腫瘤( T )區邊緣。星號標記間質(zhì)組織。YTHDF2 + CD68 + (雙陽(yáng)性)細胞數高(上)或低(下)的代表性標本見(jiàn)(圖1 )。

f ：100 μ m。黑色箭頭標記YTHDF2 + CD68 +細胞。f，間質(zhì)區YTHDF2 + CD68 +細胞與CD8 + T細胞的相關(guān)性如上所示。數據以均數±標準差( mean ± s.d. )表示，采用單因素方差分析( One-way ANOVA with a Holm-dák post test ( b , c右和d) )或兩因素方差分析( Two-way ANOVA with mixed-effect model ( a和c左) )，并采用Holm - d á k post test或Spearman相關(guān)( f )進(jìn)行校正。a，b，c和d中的數據至少代表兩個(gè)獨立的實(shí)驗。

全文小節

• 數據庫分析發(fā)現腫瘤浸潤髓系細胞高表達YTHDF2；

• TAM中敲除YTHDF2抑制腫瘤生長(cháng)和轉移（使用Lyz2 cre小鼠特異性敲除髓系細胞中YTGDF2），TAM中YTHDF2敲除增強CD8+T細胞抗腫瘤反應；

• YTHDF2敲除增強抗腫瘤巨噬細胞極化（炎性巨噬細胞增加），調節巨噬細胞抗原提呈功能；

• YTHDF2通過(guò)IFN-γ-STAT1信號通路重塑巨噬細胞，YTHDF2降低巨噬細胞Stat1 mRNA穩定性；

綜上所述，m6A閱讀蛋白YTHDF2可以通過(guò)影響IFN-γ–STAT1通路重編程TAM，增強TAM抗原提呈能力，進(jìn)而調控CD8⁺T細胞介導的抗腫瘤免疫。

云序生物單細胞研究模塊

01 MobiNova?單細胞轉錄組學(xué)

MobiNova^?單細胞測序建庫系統基于液滴微流控技術(shù)，采用突破性的微球—分子標簽技術(shù)，攜帶千萬(wàn)級別的分子標簽，可以捕獲多種樣本中的mRNA分子，以確保構建文庫具有穩定的質(zhì)量和出色的性能?？蓮V泛應用于多項課題中，如腫瘤研究中對于腫瘤異質(zhì)性及免疫微環(huán)境的研究、免疫中關(guān)于細胞分型、感染&自身免疫病的研究、神經(jīng)科學(xué)中神經(jīng)系統疾病和細胞通訊的研究以及發(fā)育生物學(xué)中的圖譜構建和細胞發(fā)育軌跡研究等等。

截至目前，MobiNova單細胞平臺已經(jīng)成功完成人、鼠及其他哺乳動(dòng)物、PBMC、腦、肝、腎、腸、骨、脂肪等多組織類(lèi)型的單細胞/單細胞核測序，質(zhì)量穩定，數據可靠！

• 數據可靠、質(zhì)量穩定：細胞投入數相同的情況下，細胞捕獲數、測序飽和度及檢測基因數均接近。

• 細胞分群高度重合：兩次獨立測序的結果顯示細胞分群高度重合。

單細胞實(shí)測數據

02 MobiNova?單細胞表觀(guān)組學(xué)（scRNA-seq&scChIP-seq）

單細胞表觀(guān)組MobiChIP-seq?的實(shí)驗原理是通過(guò)抗體和Tn5酶識別蛋白與DNA的結合位點(diǎn)，并靶向切割DNA分子?；谝旱挝⒘骺丶夹g(shù)將經(jīng)過(guò)處理的單個(gè)細胞包裹形成油包水結構，并借助帶有細胞標簽的微球捕獲DNA片段和標記DNA分子，實(shí)現蛋白與DNA位點(diǎn)結合的測序，具有高通量、超高分辨率、超強特異性的特點(diǎn)。

單細胞表觀(guān)組學(xué)MobiChIP^TM實(shí)驗流程和技術(shù)原理

MobiChIP-seq?實(shí)測數據顯示，數據結果可靠，質(zhì)量穩定；對于細胞類(lèi)群分群精準；與常規ChIP-seq數據能夠相互印證，且與單細胞轉錄組數據實(shí)現相互映射。

另外，將單細胞表觀(guān)組與單細胞轉錄組學(xué)進(jìn)行聯(lián)合分析，還可以闡明與轉錄組相關(guān)的組蛋白修飾，以及轉錄因子-DNA-mRNA間的作用機制等，從而對疾病的產(chǎn)生和發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵機制進(jìn)行深入研究。

03 單細胞平臺優(yōu)勢

細胞捕獲率高：細胞捕獲率最好可達70%

穩定性高：批次間差異小，重復性好

雙胞率低：雙胞率＜5% / 10000個(gè)細胞

云序生物m6A修飾研究五大模塊

01 m6A RNA修飾測序

m6A RNA修飾單堿基測序（m6A-GLORI-seq）北京大學(xué)官方授權專(zhuān)利技術(shù)

GLORI-Seq（Glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosine）技術(shù)是針對m6A修飾開(kāi)發(fā)的單堿基檢測技術(shù)。實(shí)現了真正意義的高效率、高靈敏度、高特異性、無(wú)偏好單堿基m6A位點(diǎn)檢測，解決了目前m6A后續研究中眾多科研工作者遇到的無(wú)法精確m6A突變位點(diǎn)的難題。

m6A RNA修飾測序（m6A-MeRIP-seq）

對m6A RNA甲基化，目前最流行的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術(shù)，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：

• m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）

• m6A  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）

• m6A  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）

• m6A  mRNA測序

• m6A  miRNA測序

02檢測整體m6A RNA修飾水平

比色法檢測整體RNA修飾水平

快速檢測m6A整體甲基化水平

03 m6A RNA修飾上游酶的篩選

m6A RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片

尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。

04 m6A RNA修飾靶基因驗證

MeRIP-qPCR/GenSeq? MeRIP試劑盒

云序提供各類(lèi)不同修飾的MeRIP-qPCR服務(wù)以及銷(xiāo)售GenSeq? MeRIP試劑盒，可針對mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類(lèi)型的RNA分子進(jìn)行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。

05機制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq? RIP試劑盒

篩選或驗證RNA修飾直接靶點(diǎn)，研究RNA修飾靶基因的調控機制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。

5.3 ChIP-seq

篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

5.4 Ribo-seq

篩選翻譯水平發(fā)生變化的RNA分子，研究相應的分子調控機制。

5.5SLAM-seq

篩選穩定性發(fā)生變化的RNA分子，研究相應的分子調控機制。

5.6CHIRP-seq

篩選或驗證目標RNA與DNA互作，研究相應的分子機制。

云序生物服務(wù)優(yōu)勢

優(yōu)勢一：云序累計支持客戶(hù)發(fā)表數百篇SCI論文，合計影響因子3000 +

優(yōu)勢二：累計完成測序樣本數萬(wàn)例，全面覆蓋醫口、農口等各類(lèi)樣本

優(yōu)勢三：全面檢測mRNA和各類(lèi)非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）

優(yōu)勢四：提供RNA修飾一站式服務(wù)：整體水平檢測、MeRIP-seq、MeRIP-qPCR驗證、RIP-seq/eclip-seq、RNA pull-down、Ribo-seq/Polysome-seq和SLAM-seq等

優(yōu)勢五：率先研發(fā)超微量MeRIP測序技術(shù)，RNA量低至500ng起

優(yōu)勢六：國內較全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化、假尿嘧啶等修飾的測序技術(shù)

云序生物m6A修飾部分客戶(hù)文章列表

RNA修飾多組學(xué)研究相關(guān)產(chǎn)品

m6A RNA甲基化測序

m5C RNA甲基化測序

m1A RNA甲基化測序

m7G RNA甲基化測序

ac4C RNA乙?；瘻y序

O8G RNA氧化修飾測序

2’-O-RNA甲基化測序

m6Am RNA甲基化測序

BID-seq假尿嘧啶測序

RNA pulldown

RNA-seq

RIP測序

Ribo-seq

SLAM-seq

ATAC-seq

CUT&Tag-seq