PNAS/Q1 云序生物助力蘇大陶金團隊揭示m6A介導神經(jīng)病理性疼痛新機制

RNA m6A修飾是一種新興的表觀(guān)遺傳調控機制，已經(jīng)被證明參與了各種病理生理過(guò)程.然而，人們對其參與調節神經(jīng)病理性疼痛的情況仍然知之甚少。云序生物助力蘇州大學(xué)陶金教授團隊在PNAS上發(fā)表題為“FOXD3-mediated transactivation of ALKBH5 promotes neuropathic pain via m6A-dependent stabilization of 5-HT3A mRNA in sensory neurons”的研究論文，該文闡明了m6A去甲基化酶ALKBH5在調節三叉神經(jīng)介導的神經(jīng)病理性疼痛中的功能作用，提示ALKBH5可能作為三叉神經(jīng)病理性疼痛潛在的治療靶點(diǎn)。云序生物有幸提供了該研究中m6A meRIP-seq與生信分析服務(wù)，同時(shí)本研究中涉及的驗證服務(wù)云序生物也均可提供，歡迎老師們線(xiàn)下線(xiàn)上咨詢(xún)！

標題： FOXD3-mediated transactivation of ALKBH5 promotes neuropathic pain via m6A-dependent stabilization of 5-HT3A mRNA in sensory neurons

發(fā)表時(shí)間：2024.1.29

發(fā)表期刊：PNAS/Q1

樣品類(lèi)型：大鼠 三叉神經(jīng)節（3 vs 3）

研究方法：m6A meRIP-seq、Chip-qPCR、m6A meRIP-qPCR、RIP-qPCR、RIP-WB

研究摘要

在這項研究中，作者闡明了 m6A 去甲基化酶ALKBH5在調節三叉神經(jīng)介導的神經(jīng)病理性疼痛中的功能作用。周?chē)窠?jīng)損傷選擇性地上調了大鼠損傷三叉神經(jīng)節（TG）中 ALKBH5 的表達水平。阻斷損傷三叉神經(jīng)節中的這種上調可減輕三叉神經(jīng)痛，而在完整的三叉神經(jīng)節神經(jīng)元中模擬 ALKBH5 的上調可充分誘導與疼痛相關(guān)的行為。從機制上講，神經(jīng)損傷誘導的組蛋白去乙?；?1下調會(huì )增加組蛋白H3K27ac，促進(jìn)轉錄因子叉頭框蛋白D3（FOXD3）與Alkbh5啟動(dòng)子結合，促進(jìn)Alkbh5的轉錄。ALKBH5的增加會(huì )清除Htr3a mRNA中的 m6A 位點(diǎn)，導致YTHDF2無(wú)法與Htr3a mRNA 結合，從而引起 5-HT3A 蛋白表達和 5-HT3 通道電流的增加。相反，阻斷 ALKBH5 在損傷 TG 中的表達，可破壞神經(jīng)損傷誘導的 5-HT3A 增加的穩定性，并逆轉機械性疼痛，這種效應可被5-HT3A 敲除所阻斷?？傊?，FOXD3 介導的 ALKBH5 反式激活通過(guò) m6A 依賴(lài)性穩定 TG 神經(jīng)元中的 Htr3a mRNA 來(lái)促進(jìn)神經(jīng)病理性疼痛。對這一機理的理解可能會(huì )推動(dòng)神經(jīng)病理性疼痛治療新靶點(diǎn)的發(fā)現。

技術(shù)路線(xiàn)

研究結果

（1）外周神經(jīng)損傷后，ALKBH5在同側Tg神經(jīng)元中表達上調

利用單側眶下神經(jīng)慢性收縮性損傷（CCI-ION）建立了三叉神經(jīng)痛的實(shí)驗模型。與假手術(shù)組相比，大鼠在 CCI-ION 后第 14 天對機械刺激的逃逸閾值急劇下降，并且這種下降在第 28 天仍保持不變。Dot blot結果表明，CCI-IION后同側 TG 中 m6A 的總體水平明顯下降。為了確定m6A 水平變化的關(guān)鍵分子，作者檢測了 CCI-ION后受損TG中m6A甲基化轉移酶和去甲基化酶的表達，結果發(fā)現單側 CCI-ION 增加了同側 TG 中 Alkbh5 mRNA 的水平，而 Fto、Wtap、Mettl3 和 Mettl14 則保持不變。隨后研究了同側 TG 中Alkbh5 表達變化的時(shí)間過(guò)程。CCI-ION 大鼠的 Alkbh5 mRNA 水平在第 14 天顯著(zhù)增加，并在第 28 天保持不變，而假手術(shù)組大鼠的 Alkbh5 mRNA 水平?jīng)]有顯著(zhù)差異。同樣，ALKBH5 蛋白表達在 CCIION 手術(shù)大鼠中以時(shí)間依賴(lài)性的方式顯著(zhù)增加，而 FTO、WTAP、METTL3 和 METTL14 的蛋白豐度在第 14 天和第 28 天沒(méi)有明顯變化。不出所料，假手術(shù)組同側TG中ALKBH5的基礎表達保持不變，在CCI-ION 手術(shù)后，對側 TG 中的 ALKBH5 蛋白表達也沒(méi)有發(fā)生任何變化。接下來(lái)研究了 ALKBH5 的細胞定位。雙染結果顯示，ALKBH5 主要與神經(jīng)元標記物 NeuN 共存，而很少與衛星膠質(zhì)細胞特異性標記物谷氨酰胺合成酶（GS）共定位，這表明 ALKBH5 主要在 TG 神經(jīng)元中表達。統計分析顯示，約 93.3% 的 ALKBH5+ TG 神經(jīng)元被 NeuN 標記，約 2.7% 被 GS 標記。進(jìn)一步檢測ALKBH5在正常大鼠外周痛覺(jué)感受器中的表達模式表明，ALKBH5 陽(yáng)性的 TG 神經(jīng)元與降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）和異凝集素B4 ( IB4 )高度共存，但與神經(jīng)絲蛋白 200（NF200）的共存率相對較低。約 32.7%的ALKBH5陽(yáng)性神經(jīng)元被CGRP標記，約 39.5% 被IB4 標記，16.9%被NF200 標記。此外，與 qPCR 結果一致，在CCI-ION 后第14天，同側TG中的ALKBH5 陽(yáng)性神經(jīng)元數量與相應的假手術(shù)組相比顯著(zhù)增加（增加了 49.2% ± 3.8%）。

圖1 .神經(jīng)損傷后ALKBH5在同側TG中表達上調

（2）ALKBH5調控三叉神經(jīng)病理性疼痛行為

為了研究ALKBH5是否參與慢性神經(jīng)病理性疼痛行為，作者在CCI-ION 14d后單側在TG內注射了化學(xué)修飾的ALKBH5-siRNA（及相應的陰性對照NC-siRNA）。結果顯示ALKBH5-siRNA（而非 NC-siRNA）顯著(zhù)抑制損傷 TG 中 ALKBH5 蛋白豐度的增加，并明顯緩解 CCI-ION 誘導的機械痛覺(jué)。隨后，作者利用慢病毒介導的shRNA研究了ALKBH5敲除（ALKBH5-down）對神經(jīng)病理性疼痛行為的影響。在CCI-ION 后 14 d 注射 ALKBH5-down 抑制了損傷 TG 中 ALKBH5 的蛋白豐度，并顯著(zhù)減輕了注射ALKBH5-down后第 3 天至第 14 天的機械痛感和熱痛覺(jué)過(guò)敏。為了驗證假設，進(jìn)一步的口面部行為評估顯示，ALKBH5-down能逆轉CCI-ION誘導總接觸時(shí)間減少，而NC-down處理則沒(méi)有這種效果。此外，在CCI-ION手術(shù)前注射ALKBH5-down后，評估了ALKBH5參與神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展的情況。與NC-down處理組相比，用ALKBH5-down預處理的CCI-ION大鼠在術(shù)后第14至21天的機械異感顯著(zhù)減少。接下來(lái)研究了在完整的 TG 中模擬神經(jīng)損傷后 ALKBH5 的增加是否會(huì )改變痛覺(jué)閾值。利用 eGFP 標記的慢病毒載體 lenti-hSyn-ALKBH5up (ALKBH5-up)進(jìn)行神經(jīng)元特異性基因遞送，誘導 ALKBH5 在 TG 神經(jīng)元中特異性表達。從TG內注射后第3天開(kāi)始，直接注射ALKBH5-up后可在完整的TG神經(jīng)元中觀(guān)察到eGFP表達，并可維持21天。同樣，注射 ALKBH5-up 后第 3 天，ALKBH5 的蛋白表達顯著(zhù)上調。在完整大鼠中，單側TG內注射ALKBH5-up可在注射后第3天明顯誘導機械超敏反應，這種超敏反應至少持續14天，而NC-up處理則沒(méi)有這種效應。這些行為學(xué)結果共同證明了ALKBH5在三叉神經(jīng)介導的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機制中起著(zhù)關(guān)鍵作用。

（3）FOXD3在CCI-ION后促進(jìn)Tg Alkbh5基因轉錄活性

基因轉錄是由與啟動(dòng)子結合的序列特異性轉錄因子控制的。為了闡明可能調控 ALKBH5 表達的轉錄因子，對 Alkbh5 轉錄起始位點(diǎn)上游約 2,000 bp（-2,129 bp 至 0 bp）的 5′ 區域進(jìn)行了缺失分析。構建了一系列 pGL3 熒光素酶報告質(zhì)粒，其中包含 Alkbh5 啟動(dòng)子區域的不同片段（pGL3-F1 至 pGL3-F5）。雙熒光素酶報告實(shí)驗顯示，與pGL3-F2 相比，只有 pGL3-F3 質(zhì)粒（-2,129 bp 至 -874 bp）的熒光素酶活性顯著(zhù)降低，這表明從 -874 bp 至 -393 bp（ΔF）的啟動(dòng)子區域含有對 Alkbh5 基因表達至關(guān)重要的順式調控元件（CRE）。此后，利用 JASPAR 數據庫（https://jaspar. genereg.net）確定了 Alkbh5 基因啟動(dòng)子ΔF區域內的轉錄因子結合位點(diǎn)。共鑒定出三種轉錄因子： MAFB、FOXD3和SP1。為了確定轉錄因子與 Alkbh5 啟動(dòng)子 ΔF 區域的相互作用，構建了攜帶 ΔF 區域的熒光素酶報告質(zhì)粒，并將其單獨與 MAFB、FOXD3 以及SP1 質(zhì)粒進(jìn)行轉染。其中ΔF區單獨與FOXD3共轉染，顯著(zhù)增強熒光素酶活性。因此，作者進(jìn)一步研究了 FOXD3 水平是否與 ALKBH5 表達的增加相關(guān)。免疫染色分析顯示，FOXD3與ALKBH5在正常大鼠的TG神經(jīng)元中強烈共表達。令人驚訝的是，從神經(jīng)損傷后第 0 天到第 28 天，FOXD3 的表達在損傷的 TG 中沒(méi)有受到明顯影響。在假手術(shù)組中也觀(guān)察到了類(lèi)似的結果。鑒于上述情況，推測神經(jīng)損傷導致的 ALKBH5 變化可能是 FOXD3 與 Alkbh5 基因啟動(dòng)子區域結合的變化。Chip-qPCR分析顯示，與假手術(shù)相比，CCIION后14 d時(shí)抗FOXD3復合物對Alkbh5啟動(dòng)子的富集程度明顯更高。

（4）HDAC11下調增強FOXD3與ALKBH5的結合

組蛋白乙?；强刂苹虮磉_的重要表觀(guān)遺傳機制。值得注意的是，組蛋白 H3 賴(lài)氨酸乙?；ò?H3K27ac、H3K18ac、H3K14ac 和 H3K9ac）以及組蛋白 H4（H4ac）的乙?；c轉錄激活相關(guān)。因此，作者檢測了 TG 組織中這些乙?；M蛋白同工酶的蛋白豐度。與假手術(shù)相比，只有 H3K27ac 蛋白水平在 CCI-ION 手術(shù) 14 d 后顯著(zhù)上調，而其他乙?；M蛋白 H3 和 H4 沒(méi)有明顯變化。隨后的免疫染色分析顯示，在 CCI-ION 或假手術(shù)的 TG 神經(jīng)元中，H3K27ac 只在 TG 細胞核中表達，并與 ALKBH5 共定位。特別是，在 CCI-ION 大鼠中，大多數 H3K27ac 高表達的 TG 神經(jīng)元也顯示出強烈的 ALKBH5 染色。此外，Chip-qPCR分析顯示抗 H3K27ac 復合物擴增了 Alkbh5 啟動(dòng)子片段。與假手術(shù)相比，在 CCI-ION 14 d 后，H3K27ac 與 Alkbh5 基因啟動(dòng)子的結合明顯增強（約 2.7 倍）。此外，與術(shù)后 7 d 的 CCI-ION 組相比，CCI-ION 14 d 后同側 TG 中 H3K27ac 與 Alkbh5 基因啟動(dòng)子的結合活性顯著(zhù)增加。與此相反，CCIION 后 7 d 的損傷 TG 中 Alkbh5 基因啟動(dòng)子中 H3K27ac 結合的富集程度沒(méi)有變化。已知的組蛋白乙?；?CBP、EP300、HAT1、KAT2A 和 KAT5 可使 H3K27發(fā)生乙?；?，而包括 HDAC1 至 HDAC11 在內的組蛋白去乙?；缚墒?H3K27 去乙?；?。qPCR 分析表明，在 CCI-ION 術(shù)后14 d 后，Hat1 和 Hdac11 的 mRNA 表達量顯著(zhù)下降，而其他去乙?；富蛞阴；笡](méi)有顯著(zhù)變化。值得注意的是，在蛋白質(zhì)水平上，只有 HDAC11 的豐度在 CCI-ION 后以時(shí)間依賴(lài)的方式持續下調，而 HAT1 蛋白的豐度沒(méi)有表現出任何顯著(zhù)變化。在假手術(shù)中，HDAC11和 HAT1的蛋白豐度在測試期間保持不變。這些結果表明，H3K27ac 的增加可能是由于 TG 中 HDAC11 的下調。此外，TG切片的免疫染色顯示，在CCI-ION和假手術(shù)大鼠中，HDAC11與ALKBH5共定位。在 CCI-ION 組和假手術(shù)組中，HDAC11 主要存在于細胞核中（用DAPI 標記），而且大多數 ALKBH5 水平較高的神經(jīng)元在受傷的 TG 中顯示出相對較低的 HDAC11 水平。進(jìn)一步研究了 HDAC11 是否在功能上參與了 CCI-ION 介導的機械痛覺(jué)。TG 內注射 lenti-hSyn-HDAC11-up （HDAC11-up）可防止 CCI-ION 誘導的 H3K27ac或 ALKBH5蛋白豐度的增加。在受傷的TG內注射HDAC11-up可顯著(zhù)減少FOXD3與Alkbh5啟動(dòng)子的結合，并明顯減輕CCI-ION誘導的機械性痛覺(jué)。此外，作者還探討了在完整的TG中模擬神經(jīng)損傷誘導的HDAC11減少是否會(huì )改變痛覺(jué)行為。在完整大鼠體內施用 HDAC11-siRNA 會(huì )顯著(zhù)增加 H3K27ac 蛋白豐度。還探討了在完整的TGs中模擬神經(jīng)損傷導致的HDAC11減少是否會(huì )改變傷害性行為。在正常大鼠中注射HDAC11 - siRNA可顯著(zhù)增加H3K27ac和ALKBH5的蛋白豐度，并增強FOXD3與Alkbh5啟動(dòng)子的結合。此外，接受單側TG內注射HDAC11 siRNA的完整大鼠在注射后第3天至第7天出現明顯的機械性超敏反應。

（5）ALKBH5介導的m6A修飾增強了Htr3A mRNA的穩定性

研究人員接下來(lái)探討了ALKBH5調控神經(jīng)病理性疼痛的潛在分子機制。鑒于 LKBH5 是 m6A的關(guān)鍵去甲基化酶，因此進(jìn)行了 m6A meRIP-seq（3 vs 3），以分析 NC上調和 ALKBH5 上調處理的 TG 細胞的 m6A 甲基化分布。

與之前的分析一致，大鼠TG中富集了m6A典型motif RRACH（R = A 或 G；H = A、U 或 C），m6A 峰在靠近終止密碼子的 3′-UTR 附近富集。通過(guò)比較NC up處理組和ALKBH5-up處理組之間的m6A峰豐度，發(fā)現共有1345個(gè)m6A-up峰和546個(gè)m6A-down峰。GO分析表明，m6A位點(diǎn)減少的轉錄本富集于離子轉運活性和陽(yáng)離子通道復合物，KEGG分析表明它們與鈣信號轉導高度相關(guān)，而鈣信號轉導在疼痛調控中起著(zhù)關(guān)鍵作用。將上述 GO 和 KEGG 分析結果基因聯(lián)合進(jìn)行交集分析，共得出了 10 個(gè)候選基因。在這10個(gè)轉錄本中，有4個(gè)轉錄本（Htr3a、Pkd1l3、Ptk2b 和 Trpc6）在 ALKBH5上調處理的 TG 中的表達水平顯著(zhù)升高，其中 Htr3a 的上調幅度最大（約 191.6%）。事實(shí)上，如 m6A meRIP-seq分析所示，與 NC-up 組相比，ALKBH5-up 處理的 TG 的 Htr3a mRNA 在 3′-UTR 中的 m6A 位點(diǎn)下調較多。 m6A meRIP-qPCR分析進(jìn)一步驗證了這些結果，結果顯示 ALKBH5-up 能顯著(zhù)降低完整 TG 中 Htr3a mRNA 的m6A水平，假手術(shù)中TG的Htr3a mRNA片段中富含m6A，而在CCI-ION 14 d后，損傷的TG中明顯降低，這表明神經(jīng)損傷誘導了m6A位點(diǎn)的缺失。此外作者還研究了這種m6A下調與ALKBH5 活性的關(guān)系，RIP-qPCR分析表明，ALKBH5 的特異性抗體可以擴增Htr3a mRNA片段，并且這種結合活性在 CCI-ION 14 d 后顯著(zhù)升高。由于 ALKBH5 的過(guò)表達可能會(huì )增加 Htr3a mRNA 的水平，作者研究了 m6A 修飾是否會(huì )影響 Htr3a mRNA 的穩定性。在轉錄抑制劑放線(xiàn)菌素 D 的存在下，ALKBH5 的過(guò)表達會(huì )延長(cháng) Htr3a mRNA 的半衰期，這表明 m6A 修飾介導了 ALKBH5 增強 Htr3a mRNA 的穩定性。由于reader對 m6A修飾的轉錄本的直接影響起著(zhù)關(guān)鍵作用，進(jìn)一步確定了參與上述過(guò)程的潛在效應因子。研究表明，已鑒定的m6A reader，包括YTHDF1 / 2 / 3和YTHDC1 / 2以及G3BP1，參與促進(jìn)靶基因的不穩定性。因此檢測了神經(jīng)損傷是否會(huì )影響這些reader在損傷的TG中的表達。令人驚訝的是，所有這些閱讀器的蛋白質(zhì)豐度在CCI - ION 后的第7天到第28天沒(méi)有明顯的變化。進(jìn)一步通過(guò)RIP-qPCR檢測Htr3a mRNA與m6A reader蛋白的結合，發(fā)現通過(guò)YTHDF2 特異性抗體富集可以擴增出Htr3a mRNA片段，并且在CCI - ION后14 d，這種結合顯著(zhù)降低。ALKBH5介導的m6A修飾通過(guò)YTHDF2依賴(lài)的mRNA降解抑制Htr3a的表達。作為對這一假設的補充，TG切片的雙重免疫熒光分析顯示，在大鼠TG神經(jīng)元中，無(wú)論是ALKBH5還是YTHDF2，都與5 - HT3A有很強的共定位。

（6）5-HT3A在CCI后損傷的Tg中表達上調

作者評估了TG 5-HT3A在調節三叉神經(jīng)介導的神經(jīng)病理性疼痛行為中的潛在作用。與假手術(shù)組相比，在 CCI-ION 手術(shù)后 14、21 和 28 d，同側 TG 中 5-HT3A 蛋白表達水平顯著(zhù)增加，而 5-HT3B 蛋白豐度沒(méi)有變化。不出所料，假手術(shù)組的 5-HT3A 或 5-HT3B 蛋白表達也沒(méi)有明顯變化。接下來(lái)研究了 5-HT3A 的細胞定位。對完整大鼠 TG 切片的雙重標記分析表明，5-HT3A 主要與 NeuN 共存，但很少與 GS 共定位，這表明 5-HT3A 主要在 TG 神經(jīng)元中表達。此外，5-HT3A 與 CGRP 和 IB4 有很強的共聚焦作用，但在 NF200 陽(yáng)性神經(jīng)元中的表達相對較少。接下來(lái)測定了神經(jīng)損傷引起的 5-HT3A 蛋白豐度增加是否會(huì )改變逆向標記的小 TG 神經(jīng)元中的 5-HT3 電流。結果顯示，CCI-ION 明顯增強了 5-HT3 電流。峰值電流密度從假組的 10.8 ± 0.6 pA/pF 增加到 CCI-ION 組的 15.8 ± 1.2 pA/pF。5-HT3A 表達增加的功能意義在整個(gè)動(dòng)物水平上得到了進(jìn)一步檢驗。昂丹司瓊（1 μM）是一種特異性 5-HT3 阻斷劑，可顯著(zhù)降低 CCI-ION 組和假手術(shù)組的 5-HT3 電流。TG 內注射昂丹司瓊（1 nmol）可減輕 CCI-ION 大鼠的機械異感。在假手術(shù)中，TG 內注射昂丹司瓊或藥物均不會(huì )改變基礎閾值。為了進(jìn)一步確定 CCI-ION 誘導的 5-HT3 電流增加是否是由 5HT3A 同工酶引起的，我們通過(guò)化學(xué)修飾 siRNA 敲除了受傷 TG 中的 5-HT3A。在 TG 內注射 5-HT3A-siRNA 顯著(zhù)降低了 CCI-ION 介導的 5-HT3A 蛋白豐度的增加和 5HT3 電流的增加。

圖6. CCIION 術(shù)后 TG 中 5-HT3A 上調

（7）5 - Ht3A負責ALKBH5介導的痛覺(jué)行為

作者進(jìn)一步研究了調節 ALKBH5 是否會(huì )改變 CCI-ION 后 TG 5-HT3A 蛋白的表達和功能。施用 ALKBH5-siRNA 明顯抑制了 CCI-ION 后損傷 TG 中 5-HT3A 蛋白豐度的增加。ALKBH5-siRNA的應用也阻止了 CCI-ION 誘導的逆向標記的小 TG 神經(jīng)元中 5-HT3 電流的增加。此外，為了探索在完整的TG神經(jīng)元中模擬CCI-ION誘導的ALKBH5增加是否會(huì )改變5-HT3A的表達。WB表明ALKBH5-up 處理的 TG 中 5-HT3A 蛋白豐度顯著(zhù)增加。對小 TG 神經(jīng)元的進(jìn)一步記錄表明，ALKBH5 的過(guò)表達能顯著(zhù)增強 5-HT3 電流。為了驗證 5-HT3A 是否真正介導了 ALKBH5 誘導的疼痛行為，在 TG 內注射 ALKBH5-siRNA 的同時(shí)在 TG 神經(jīng)元中注射了 5-HT3A-siRNA 。第 0 天注射 5-HT3A-siRNA，第 3 天注射 ALKBH5-siRNA。與 NC-siRNA 組相比，注射 5-HT3A-siRNA 明顯減輕了 CCI-ION 誘導的機械異感。從第 3 天到第 5 天，ALKBH5-siRNA 體內注射后的逃逸閾值保持穩定，這表明進(jìn)一步注射 ALKBH5-siRNA （第 3 天）不會(huì )對 CCI-ION 誘導的機械痛覺(jué)產(chǎn)生任何疊加效應。在TG內注射ALKBH5-siRNA后，逃逸閾值從第3天到第5天保持穩定，這表明繼續注射ALKBH5-siRNA（第3天）不會(huì )對5-HT3A-siRNA預處理的CCIION大鼠的逃逸閾值產(chǎn)生任何疊加效應。相比之下，TG 內注射 ALKBH5siRNA 能顯著(zhù)提高 NC-siRNA 處理的 CCIION 大鼠對機械刺激的逃逸閾值（圖 7E）。因此，5HT3A 是 ALKBH5 介導的痛覺(jué)行為的元兇。

圖 7. 5-HT3A 是 ALKBH5 介導的痛覺(jué)行為的原因

全文小節

大鼠損傷三叉神經(jīng)節（TG）中 ALKBH5 的上調可充分誘導疼痛相關(guān)行為。

神經(jīng)損傷誘導的組蛋白去乙?；?1下調增加組蛋白H3K27ac，從而促進(jìn)轉錄因子FOXD3與Alkbh5啟動(dòng)子結合，促進(jìn)其轉錄。

ALKBH5的增加下調Htr3a mRNA中 m6A修飾，導致YTHDF2無(wú)法與Htr3a mRNA 結合從而增加其穩定性，增強 5-HT3A 蛋白表達和 5-HT3 通道電流。

云序生物m6A修飾研究五大模塊

01 m6A RNA修飾測序

m6A RNA修飾單堿基測序（m6A-GLORI-seq）北京大學(xué)官方授權專(zhuān)利技術(shù)

GLORI-Seq（Glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosine）技術(shù)是針對m6A修飾開(kāi)發(fā)的單堿基檢測技術(shù)。實(shí)現了真正意義的高效率、高靈敏度、高特異性、無(wú)偏好單堿基m6A位點(diǎn)檢測，解決了目前m6A后續研究中眾多科研工作者遇到的無(wú)法精確m6A突變位點(diǎn)的難題。

m6A RNA修飾測序（m6A-MeRIP-seq）

對m6A RNA甲基化，目前最流行的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術(shù)，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：

m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）

m6A  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）

m6A  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）

m6A  mRNA測序

m6A  miRNA測序

02檢測整體m6A RNA修飾水平

比色法檢測整體RNA修飾水平

快速檢測m6A整體甲基化水平

03 m6A RNA修飾上游酶的篩選

m6A RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片

尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。

04 m6A RNA修飾靶基因驗證

MeRIP-qPCR/GenSeq? MeRIP試劑盒

云序提供各類(lèi)不同修飾的MeRIP-qPCR服務(wù)以及銷(xiāo)售GenSeq? MeRIP試劑盒，可針對mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類(lèi)型的RNA分子進(jìn)行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。

05機制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq? RIP試劑盒

篩選或驗證RNA修飾直接靶點(diǎn)，研究RNA修飾靶基因的調控機制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。

5.3 ChIP-seq

篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

5.4 Ribo-seq

篩選翻譯水平發(fā)生變化的RNA分子，研究相應的分子調控機制。

5.5 SLAM-seq

篩選穩定性發(fā)生變化的RNA分子，研究相應的分子調控機制。

5.6 CHIRP-seq

篩選或驗證目標RNA與DNA互作，研究相應的分子機制。

云序生物服務(wù)優(yōu)勢

優(yōu)勢一：云序累計支持客戶(hù)發(fā)表數百篇SCI論文，合計影響因子3000 +

優(yōu)勢二：累計完成測序樣本數萬(wàn)例，全面覆蓋醫口、農口等各類(lèi)樣本

優(yōu)勢三：全面檢測mRNA和各類(lèi)非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）

優(yōu)勢四：提供RNA修飾一站式服務(wù)：整體水平檢測、merip-seq、MeRIP-qPCR驗證、RIP-seq/eclip-seq、RNA pull-down、Ribo-seq/Polysome-seq和SLAM-seq等

優(yōu)勢五：率先研發(fā)超微量MeRIP測序技術(shù)，RNA量低至500ng起

優(yōu)勢六：國內較全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化、假尿嘧啶等修飾的測序技術(shù)

云序生物m6A修飾部分客戶(hù)文章列表