IF=20.4 高分ac4C新鮮出爐||云序助力客戶(hù)探究ac4C與**和免疫相關(guān)新機制

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節炎（RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其特征是持續性滑膜炎癥以及軟骨和骨骼破壞。近日，云序生物助力中山大學(xué)附屬**醫院許韓師和肖游君團隊通過(guò)acRIP-seq & RNA-seq等多種方法結合成功在BMJ旗下Annals of the Rheumatic Diseases期刊上在線(xiàn)發(fā)表文章《NAT10 promotes synovial aggression by increasing the stability and translation of N4-acetylated PTX3 mRNA in rheumatoid arthritis》，**探究了類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節炎（rheumatoid arthritis, RA）成纖維樣滑膜細胞中乙?；D移酶10（NAT10）介導的N4-乙酰胞嘧啶（N4-acetylcytidine, ac4C）修飾作用，共同闡明了NAT10介導的PTX3 mRNA的ac4C修飾是調控滑膜侵襲和炎癥的新機制，同時(shí)也為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節炎**提供了潛在的**靶點(diǎn)。

云序生物有幸為該研究提供了ac4C RNA修飾測序及轉錄組測序及生信分析服務(wù)，同時(shí)本研究中涉及的驗證服務(wù)云序生物也都可提供，歡迎老師們線(xiàn)下線(xiàn)上咨詢(xún)?，F在就讓小編為老師們分享下這篇文章的主要內容吧！

標題：NAT10 promotes synovial aggression by increasing the stability and translation of N4-acetylated PTX3 mRNA in rheumatoid arthritis

發(fā)表時(shí)間：2024.5.8

發(fā)表期刊：Annals of the?Rheumatic?Diseases

影響因子：20.3

樣品類(lèi)型：人滑膜細胞（3 vs 3）

研究方法：acRIP-seq &RNA-seq & acRIP-qPCR & RIP-qPCR

研究摘要

近年來(lái)的研究發(fā)現，Nacetyltransferase 10（NAT10）介導的ac4C修飾在炎癥和免疫浸潤中起著(zhù)獨特的作用。本研究作者首先從已確診的RA患者中提取FLSs，驗證NAT10基因及蛋白的表達并檢測整體修飾水平。同時(shí)，利用acRIP-seq & RNA-seq聯(lián)合分析鑒定出NAT10的潛在靶點(diǎn)，采用RIP-qPCR實(shí)驗驗證NAT10與靶基因mRNA的相互作用。結果發(fā)現RA患者FLSs和滑膜中NAT10和ac4C水平升高，NAT10敲除或特異性抑制劑**可減少RA FLSs的遷移和侵襲，且滑膜內NAT10水平升高與滑膜內多種免疫細胞浸潤呈正相關(guān)。體內抑制NAT10可減輕CIA和DTHA小鼠以及CIA大鼠關(guān)節炎的嚴重程度。機制上，NAT10通過(guò)促進(jìn)乙?；疨TX3 mRNA的穩定性和翻譯效率來(lái)調節RA FLS侵襲和功能。*終揭示NAT10介導的ac4C修飾在促進(jìn)類(lèi)風(fēng)濕滑膜侵襲和炎癥中的重要作用，表明NAT10可能是**RA甚至其他FLSs失調相關(guān)疾病的潛在靶點(diǎn)。

技術(shù)路線(xiàn)

研究結果

1、NAT10介導的ac4C修飾在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節炎（RA）患者的成纖維細胞樣滑膜細胞（FLS）和滑膜組織中升高

與健康對照組（HC FLS）相比，RA FLS中NAT10的轉錄本水平和蛋白表達水平均升高，LC/MS整體水平檢測發(fā)現ac4C的整體水平升高。NAT10敲低或Remodelin（胞苷乙酰轉移酶蛋白 NAT10 的假定小分子抑制劑）處理也能降低RA FLS中ac4C的整體修飾水平。同時(shí)，與HC相比，RA滑膜組織中NAT10的表達增加，且NAT10的表達與RA患者的28個(gè)關(guān)節疾病活動(dòng)評分-紅細胞沉降率 （ESR） 評分之間存在**相關(guān)性。*終結果表明NAT10介導的ac4C可能參與了RA的發(fā)病機制。

2、NAT10調節RA FLS的遷移和侵襲且其在RA FLS中的表達升高與免疫細胞浸潤有關(guān)

通過(guò)構建NAT10敲低及過(guò)表達的細胞系，發(fā)現NAT10敲低降低了RA FLS的遷移和侵襲，過(guò)表達NAT10促進(jìn)了RA FLS的遷移和侵襲。同時(shí)，Remodelin處理可抑制NAT10的表達，減少RA FLS的遷移和侵襲和RA FLS 中的板狀偽足形成，但不影響細胞活力和RA FLS的增殖和凋亡。這些結果說(shuō)明NAT10參與調節RA FLS的侵襲性行為，但不參與增殖、凋亡或細胞因子和MMP的表達。同時(shí)，與shNAT10 RA FLS組相比，NAT10過(guò)表達的RA FLS中，樹(shù)突狀細胞（DC）、T細胞和B細胞的浸潤**增加。這表明NAT10在RA FLS中的表達與滑膜免疫細胞浸潤有關(guān)。

3、PTX3是RA FLS中NAT10的ac4C修飾靶點(diǎn)

為了研究NAT10調節RA FLS功能的潛在機制，作者對帶有shNAT10和shNC的RA FLS分別進(jìn)行acRIP-seq和RNA-seq結果發(fā)現shNAT10組有565個(gè)低乙?；搴?42個(gè)高乙?；澹▅log2FC|≥1），ac4C修飾峰主要位于mRNA轉錄本的蛋白質(zhì)編碼區（CDS），且在富含C的序列中高度富集。同時(shí)，RNA-seq顯示在NAT10敲低后，547個(gè)基因下調，591個(gè)基因上調（|log2FC|≥1）。進(jìn)一步分析發(fā)現，少數差異低乙?；?*富集在細胞骨架組織等通路中，許多表達差異下調基因與趨化性有關(guān)。盡管NAT10對細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、CCL2、MMP1、MMP2、MMP-3和MMP-9的影響很小，但作者推測它可以通過(guò)影響其他趨化因子（如CCR7、CXCR1、CXCL5和CXCL14）增強RA FLS的趨化能力。結果表明，暴露于NAT10可以調節與遷移和侵襲相關(guān)的少數基因，這表明NAT10對于RA FLS和免疫細胞的遷移至關(guān)重要。

為了確定NAT10調控的下游主要靶基因，篩選出NAT10敲低后乙?；揎椊档颓一虮磉_水平降低的基因，并通過(guò)acRIP-qPCR驗證了前5個(gè)基因（IL-26、STC2、PTX3、ALDHIL2 和 SYNE2）。結果發(fā)現敲除NAT10后，5個(gè)基因的修飾均**下調，但在RA FLS中，只有PTX3的表達存在**差異，IL-26、STC2、ALDHIL2和SYNE2的表達則沒(méi)有差異。同時(shí)進(jìn)一步分析發(fā)現，NAT10的敲低導致PTX3的CDS和5'UTR上的乙?；?*降低。先前研究報道，PTX3在血清和滑膜樣本中的水平均升高，且與RA嚴重程度和免疫細胞浸潤呈正相關(guān)。因此，作者推測NAT10通過(guò)乙?；疨TX3 mRNA來(lái)調節RA FLS的侵襲性行為。

除此之外，實(shí)驗還觀(guān)察到NAT10敲除后，PTX3的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平持續下降，PTX3的CDS和5'UTR乙?；档?。進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶報告基因檢測發(fā)下NAT10抑制**降低了WT PTX3報告基因的熒光素酶活性，但對shNC RA FLS中的Mut1和Mut2報告基因沒(méi)有影響，這表明NAT10依賴(lài)于PTX3 mRNA CDS和5`UTR的ac4C修飾，直接調節PTX3的表達。同時(shí)，還發(fā)現PTX3 CDS和5'UTR的ac4C修飾還影響RA FLS中PTX3 mRNA的翻譯效率。對RA FLS的NAT10 RIP-qPCR結果表明，NAT10可以與RA FLS中的PTX3 mRNA結合，NAT10敲除組中NAT10與PTX3 mRNA的結合**降低。因此，研究結果表明NAT10介導的ac4C乙?；揎椡ㄟ^(guò)影響mRNA穩定性和翻譯效率來(lái)調節PTX3表達。

4、PTX3在調節RA FLS遷移和侵襲以及免疫細胞滑膜浸潤中的作用

PTX3基因在RA FLS和HC FLS均表達，但與HC FLS相比，RA FLS中PTX3 mRNA和蛋白質(zhì)的表達增加。與HC受試者相比，RA患者滑膜組織中的PTX3水平也明顯升高。另外，作者還構建了PTX3敲低或過(guò)表達體系來(lái)探究其對RA FLS遷移和侵襲的影響。結果發(fā)現，PTX3敲低抑制了細胞遷移和侵襲，還導致板狀偽足形成受到抑制。PTX3過(guò)表達**逆轉了NAT10敲除對細胞遷移和侵襲的影響，表明PTX3介導NAT10誘導的RA FLS侵襲行為。之前的研究已經(jīng)表明PTX3存在于RA患者的滑液和血清中，因此作者推測NAT10可能控制RA FLS分泌PTX3。NAT10敲低降低了培養的RA FLS中PTX3的表達。進(jìn)一步發(fā)現，用重組人PTX3**可促進(jìn)RA FLS的遷移和侵襲。這些結果表明，NAT10誘導的PTX3分泌以自分泌方式促進(jìn)RA FLS的遷移和侵襲。**，作者估計了PTX3敲除及過(guò)表達RA FLS組之間的免疫細胞比例，發(fā)現在PTX3高表達組中，DCs、T細胞和B細胞的浸潤**增加。在RA患者的滑膜PDPN+FLS中，NAT10水平與PTX3呈正相關(guān)。

5、NAT10抑制可減輕RA模型中的關(guān)節炎的嚴重程度

通過(guò)建立兩種RA動(dòng)物模型，即膠原Ⅱ型誘發(fā)性關(guān)節炎（CIA）大鼠或小鼠和遲發(fā)型超敏性關(guān)節炎（DTHA）小鼠，作者評估了NAT10敲除對關(guān)節炎進(jìn)展的影響。結果發(fā)現，與對照組相比，NAT10的敲除降低關(guān)節炎的評分、后爪體積和踝關(guān)節周長(cháng)，骨破壞較少，且骨表面與骨體積（BS/BV）比值較低。NAT10的敲除還減少了關(guān)節內的滑膜增生以及軟骨和骨質(zhì)破壞，在局部關(guān)節內敲低NAT10后，CIA大鼠滑膜組織中NAT10和PTX3的表達降低。同時(shí)，口服Remodelin的小鼠的關(guān)節炎評分低于對照組，Remodelin處理還減少了滑膜炎癥、增生、骨質(zhì)侵蝕和軟骨破壞。此外，Remodelin處理組與對照組之間肝臟和腎臟組織均未發(fā)現**的組織病理學(xué)變化，提示Remodelin**的安全性。進(jìn)一步觀(guān)察發(fā)現，Remodelin**組滑膜組織中PTX3的表達低于對照組。**，作者還利用NAT10雜合缺失小鼠（NAT10+/mice）構建了DTHA關(guān)節炎模型。結果發(fā)現，與WT小鼠相比，NAT10+/-小鼠的爪腫脹程度和關(guān)節炎評分降低。與WT小鼠相比，NAT10+/-小鼠的滑膜炎癥、增生、骨侵蝕和軟骨破壞均有**改善。有趣的是，DTHA模型中NAT10+/-小鼠滑膜組織中浸潤的CD3+T細胞、CD19+B細胞和CD11c+DC比WT小鼠少，NAT10+/-小鼠滑膜組織中 PTX3表達低于WT小鼠。

全文小結

• NAT10介導的ac4C修飾在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節炎（RA）患者的成纖維細胞樣滑膜細胞（FLS）和滑膜組織中升高

• NAT10調節RA FLS的遷移和侵襲且其在RA FLS中的表達升高與免疫細胞浸潤有關(guān)

• PTX3是RA FLS中NAT10的ac4C修飾靶點(diǎn)，NAT10介導的ac4C乙?；揎椡ㄟ^(guò)影響mRNA穩定性和翻譯效率來(lái)調節PTX3表達。NAT10通過(guò)乙?；疨TX3 mRNA來(lái)調節RA FLS的侵襲性行為

• PTX3在調節RA FLS遷移和侵襲以及免疫細胞滑膜浸潤中的作用

• NAT10抑制可減輕RA模型中的關(guān)節炎的嚴重程度

云序生物ac4C修飾研究四大模塊

1、ac4C RNA修飾測序

ac4C RNA修飾單堿基測序（RedaC:T-seq）

RedaC:T-seq可以實(shí)現ac4C RNA乙?；揎椀膯螇A基分辨檢測。通過(guò)NaBH4處理，將ac4C還原為四氫ac4C，但不影響未發(fā)生修飾的胞苷，在逆轉錄時(shí)，經(jīng)過(guò)NaBH4處理后形成的四氫ac4C可以與T配對，未發(fā)生修飾的胞苷仍然與G配對，通過(guò)對比兩組樣本的測序結果，可以將RNA乙?；揎椢稽c(diǎn)單堿基定位到轉錄組上，還可根據RNA-seq數據，計算樣本中RNA乙?；潭燃皩NA表達水平的影響。

ac4C RNA修飾測序（acRIP-seq）

對ac4C RNA乙?；?，目前***的檢測手段為acRIP-seq技術(shù)，適用于ac4C RNA乙?；V研究，快速篩選ac4C RNA乙?；谢?。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的修飾測序：

• ac4C 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）

• ac4C  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）

• ac4C  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）

• ac4C  mRNA測序

• ac4C  miRNA測序

2、ac4C RNA修飾上游酶的篩選

ac4C RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片

尋找上游直接調控ac4C RNA乙?；拿?。

3、ac4C RNA修飾靶基因驗證

MeRIP-qPCR/GenSeq? MeRIP試劑盒

云序提供各類(lèi)不同修飾的MeRIP-qPCR服務(wù)以及銷(xiāo)售GenSeq? MeRIP試劑盒，可針對mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類(lèi)型的RNA分子進(jìn)行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。

4、機制互作研究

RIP-seq/qPCR/GenSeq? RIP試劑盒

篩選或驗證RNA修飾直接靶點(diǎn)，研究RNA修飾靶基因的調控機制。

RNA pull down -MS/WB

篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。

ChIP-seq

篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

Ribo-seq

篩選翻譯水平發(fā)生變化的RNA分子，研究相應的分子調控機制。

SLAM-seq

篩選穩定性發(fā)生變化的RNA分子，研究相應的分子調控機制。

CHIRP-seq

篩選或驗證目標RNA與DNA互作，研究相應的分子機制。

云序生物服務(wù)優(yōu)勢

優(yōu)勢一：云序累計支持客戶(hù)發(fā)表數百篇SCI論文，合計影響因子3000 +

優(yōu)勢二：累計完成測序樣本數萬(wàn)例，**覆蓋醫口、農口等各類(lèi)樣本

優(yōu)勢三：**檢測mRNA和各類(lèi)非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）

優(yōu)勢四：提供RNA修飾一站式服務(wù)：整體水平檢測、RNA修飾研究、MeRIP-qPCR驗證、RIP-seq、RNA pull-down、Ribo-seq和SLAM-seq等

優(yōu)勢五：率先研發(fā)超微量MeRIP測序技術(shù)，RNA量低至500ng起

優(yōu)勢六：國內較全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化、假尿嘧啶等修飾的測序技術(shù)

云序生物ac4C RNA修飾**IF10+文章列表

RNA修飾多組學(xué)研究相關(guān)產(chǎn)品

m6A RNA甲基化測序

m5C RNA甲基化測序

m1A RNA甲基化測序

m7G RNA甲基化測序

ac4C RNA乙?；瘻y序

O8G RNA氧化修飾測序

2’-O-RNA甲基化測序

m6Am RNA甲基化測序

BID-seq假尿嘧啶測序

RNA pulldown

RNA-seq

RIP測序

Ribo-seq

SLAM-seq

ATAC-seq

CUT&Tag-seq

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